抗体的纯化方法、抗体和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗体的纯化方法、抗体和应用，涉及蛋白纯化的技术领域。该纯化方法包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；其中组合层析依次包括(a)亲和层析以捕获抗体；(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理。该抗体纯化方法具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高的优点。

Purification method, antibody and application of antibody

【技术实现步骤摘要】
抗体的纯化方法、抗体和应用
本专利技术涉及蛋白纯化
，尤其是涉及一种抗体的纯化方法、抗体和应用。
技术介绍
1986年首次治疗性单克隆抗体(单抗)获得批准后，人们对治疗性单抗的需求显着增加。截止2015年11月，53种新型治疗性单克隆抗体进入3期临床研究，比2009年增加了104％，其中六个已于2016年在欧盟或美国首次获得批准。目前每年约有4种新的治疗性单抗产品的获得上市批准，按照这样的增加速度，到2020年市场上预计将会有70种单抗，全球销售额将达到1250亿美元。治疗单克隆抗体的纯化制备，多数是基于ProteinA的亲和层析作为第一步进行纯化，但是通常情况下，一步ProteinA亲和层析的纯度等方面达不到治疗抗体的要求(一般纯度要求>95％)，另外由于是CHO细胞系作为宿主表达抗体时，细胞培养上清中，不仅含有目标抗体，而且还有宿主蛋白(HCP)，宿主DNA(HCD)等杂质，单纯一步ProteinA层析去除不掉全部的杂质，需要额外增一步或者几步层析过程来满足要求。治疗性单克隆抗体最常见的纯化工艺的层析过程是ProteinA(亲和层析，AC)，脱盐(BEX)，阳离子交换(CEX)，脱盐(BEX)，阴离子交换(AEX)。脱盐过程可以使用脱盐柱或者超滤脱盐。目前，几乎大部分纯化工作人员都是采用的手动一步层析方法，每步层析都需要单独的上样，洗脱，处理样品，然后进行下一步层析操作，极少同时用到手动两步层析方法进行纯化。手动层析不仅会造成样品的损失，而且人工耗时多，设备投入量较大。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种抗体的纯化方法，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高的优点。本专利技术的第二目的在于提供一种使用上述抗体的纯化方法纯化得到的抗体。本专利技术的第三目的在于提供一种上述抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：本专利技术提供了一种抗体的纯化方法，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTAAvant150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:(a)亲和层析以捕获抗体；(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；其中，AKTAAvant150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position1。优选地，用于步骤(a)的亲和层析柱中的填料包括ProteinA、ProteinG或ProteinL中的至少一种；优选为ProteinA。优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式包括：离子交换层析、亲和层析、羟基磷灰石层析或疏水相互作用层析。优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为离子交换层析，优选为阳离子交换层析。优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为疏水相互作用层析。优选地，所述纯化方法还包括将AKTAAvant150的样品泵的上样入口设置为变量，以用于依次纯化多个抗体样品。优选地，所述组合层析的流路包括：(x1)亲和上样：抗体粗品经Samplepump从Injectionvalve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Fractioncollection，进行收集流传液；(x2)亲和Wash杂质：BufferA1经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste，流出后至废弃液中；(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：BufferB1经SystempumpB从Injectionvalve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Outletvalve，峰收集后不经排出重新流回Injectionvalve并注入凝胶过滤层析柱；(x4)层析上样：BufferA2经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Outletvalve，流出后收集滤液；(x5)层析洗脱：将BufferA2经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，同时BufferB2经SystempumpB从Injectionvalve注入管路后流经层析柱进行梯度洗脱，以洗脱与层析柱结合的抗体，然后滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve后流至FractionCollection，流出后收集滤液得到纯化后的抗体。优选地，所述组合层析的流路还包括用于层析柱再生的步骤：(x6)步骤(a)中使用的亲和层析柱再生：将BufferB3经SystempumpB从Injectionvalve注入管路，经亲和层析柱以洗掉杂质进行再生处理，滤液依次流经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste，然后将BufferA1经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，经亲和层析柱以洗掉柱子中残留的碱溶液，滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste。(X7)步骤(b)和步骤(c)中使用的层析柱再生：将BufferB3经SystempumpB从Injectionvalve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste，然后将BufferA2，经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，先经步骤(b)使用的凝胶过滤层析柱，后经步骤(c)中使用的层析柱，滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste。优选地，经凝胶过滤层析柱脱盐的抗体混合后上样至阳离子交换层析柱；流路使用的缓冲液包括：BufferA1：PBS，pH7.2～7.4；BufferA2：pH为5.0～5.5，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；BufferB1：pH为3.2～3.4，含有浓度为20～50mM的NaAC溶液；Bu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体的纯化方法，其特征在于，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTA Avant 150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:/n(a)亲和层析以捕获抗体；/n(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；/n(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；/n其中，AKTA Avant 150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position 1。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体的纯化方法，其特征在于，包括：提供含有抗体粗品的细胞发酵液；提供用于层析的缓冲液；然后使用AKTAAvant150对抗体粗品进行组合层析；所述组合层析依次包括如下步骤:
(a)亲和层析以捕获抗体；
(b)凝胶过滤层析置换Buffer以脱盐；
(c)再次层析分离抗体以对抗体进行精纯处理；
其中，AKTAAvant150中管路与层析柱的连接方式为：设备的Out1出口连接到Loop环的上样口，将用于步骤(a)的亲和层析柱连在柱位Position3；将用于步骤(b)的凝胶过滤层析柱替换掉Loop环；将用于步骤(c)的层析柱连接在柱位Position1。


2.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，用于步骤(a)的亲和层析柱中的填料包括ProteinA、ProteinG或ProteinL中的至少一种；优选为ProteinA。


3.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式包括：离子交换层析、亲和层析、羟基磷灰石层析或疏水相互作用层析；
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为离子交换层析，优选为阳离子交换层析；
优选地，步骤(c)中再次层析分离抗体的方式为疏水相互作用层析。


4.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括将AKTAAvant150的样品泵的上样入口设置为变量，以用于依次纯化多个抗体样品。


5.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述组合层析的流路包括：
(x1)亲和上样：抗体粗品经Samplepump从Injectionvalve注入管路，流经亲和层析柱与层析柱中填料特异性结合，然后滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Fractioncollection，进行收集流传液；
(x2)亲和Wash杂质：BufferA1经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，流经亲和层析柱洗脱杂质，然后滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Waste，流出后至废弃液中；
(x3)亲和洗脱抗体和凝胶过滤层析上样：BufferB1经SystempumpB从Injectionvalve注入管路后流经亲和层析柱，以用于亲和洗脱被亲和层析柱捕获的抗体，然后带有抗体样品的滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Outletvalve，峰收集后不经排出重新流回Injectionvalve并注入凝胶过滤层析柱；
(x4)层析上样：BufferA2经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，将抗体样品从凝胶过滤层析柱洗脱的同时上样至步骤(c)使用的层析柱中，滤液依次经UVmonitor、Conductivitymonitor和pHvalve流至Outletvalve，流出后收集滤液；
(x5)层析洗脱：将BufferA2经SystempumpA从Injectionvalve注入管路，同时BufferB2经...

【专利技术属性】
技术研发人员：季红斌，邓勇民，钟冬梅，孟媛，柏艳辉，范凌云，
申请(专利权)人：菲鹏生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44