一种纳米抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米抗体制备方法，通过将目的抗原免疫动物，获得免疫后的动物外周血单个核细胞，并富集B细胞，用FITC荧光标记目的抗原，使用半固体培养基培养细胞，形成独立单个B细胞克隆，挑选分泌阳性重链抗体的单个B细胞克隆，提取阳性B细胞总RNA，逆转录成cDNA，并进行VHH片段扩增及测序，纳米抗体的重组表达和活性鉴定。本发明专利技术的方法可以直接观察并挑选分泌VHH抗体的阳性B细胞克隆，通过分泌的抗体形成荧光信号，更符合B细胞抗体分泌功能特性。本发明专利技术方法筛选制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性强、亲和力高、可溶性好、容易表达等优势，用途广泛。

A preparation method of nano antibody

【技术实现步骤摘要】
一种纳米抗体制备方法
本专利技术属于生物
，涉及一种纳米抗体制备方法，可快速挑选和制备抗原特异性纳米抗体。
技术介绍
哺乳动物(包括人)的抗体一般由两条重链与两条轻链组成，重链的Fc区域能保证抗体在体内有较长的半衰期。传统的抗体药物具有一些不可避免的缺点：分子较大，难以穿透组织和细胞，尤其是血脑屏障等生理屏障；制备、保存和运输过程中容易聚集、沉淀；容易引发抗抗体反应；筛选到具有生物活性的高亲和力抗体几率较低。1993年，比利时科学家Hamers-Casterman等在骆驼和羊驼体内发现一种新的抗体，这种抗体只有传统抗体的1/10，却完全具备了抗体活性，即能够有效识别靶向抗原，并且此类抗体具有能够穿透组织，到达病变位置的能力，而且这种抗体稳定性极佳，能够耐受较强的温度和酸碱性刺激，免疫原性低，亲和力高，而且容易进行体外化学和生物学修饰，是良好的抗体药物。这种抗体现在被称为纳米抗体(nanobody)，纳米抗体同样含有3个CDR，其中CDR3对亲和力起到主要作用。与人抗体VH相比，CDR3更长，可以形成凸环结构，能够深入抗原内部更好的结合抗原，因而亲和力更高。此外，VHH的FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性更好，不易形成聚集体。所以，纳米抗体的广泛应用在生物医药领域将带来一场巨大变革。相较于普通抗体，纳米抗体具有以下优势：1)针对不同种类的抗原，抗体制备的成功率较高，亲和力可达到nM甚至pM级别；2)通过基因工程进行抗体组合，不仅能够提高亲和力和特异性，而且能识别更多的抗原；3)可与其他技术联合做新型治疗方法；4)可用于不同的给药方式，包括吸入、口服、滴眼等；5)独特的稳定性，包括热稳定性和对酸碱的耐受性；6)生产成本相对较低，可以采用原核培养(细菌或酵母)的生产体系，高浓度时不易聚集。纳米抗体具有广阔的应用范围。在药物治疗领域，Fc域的缺失使得纳米抗体安全性得以提高，在作为纯粹的免疫调节分子时，纳米抗体的有效性也会提高。纳米抗体的小分子量，使得其容易达到渗透到某些难以达到的癌变组织，分布均一性更好。在抗感染方面，纳米抗体可以通过阻断病毒-细胞结合、病毒进入、病毒包被等过程，防止病毒的扩散。血脑屏障是中枢神经系统疾病药物开发的一个重大障碍，一些纳米抗体可以穿透血药屏障，使纳米抗体在治疗神经系统疾病具有独特的潜力。此外，纳米抗体在基础研究领域、生物成像和生物学检测等领域均具有独特的应用价值。目前的纳米抗体制备和筛选平台大部分基于噬菌体展示技术，通过提取免疫羊驼的B细胞转录组，构建噬菌体展示文库，经过几轮严格的抗原筛选，最终得到特异性纳米抗体。也有部分实验室采用其它文库展示技术，例如酵母展示和核糖体展示等。这些技术的最大缺陷是抗体多样性不够，在制备文库的过程中丢失了大量抗体信息。例如，羊驼免疫后B细胞库中的抗体多样性可以达到1013以上，而大多数文库的多样性都在109以下，经过几轮筛选后，高亲和力的特异性抗体所剩无几。另外，不是所有的序列都能在噬菌体中很好的表达，有些蛋白不能形成正确的折叠而被降解。目前大部分单次制备的针对单一抗原的高亲和力纳米抗体的筛选得率均在10个以下。而具有免疫治疗效果的抗体不仅需要具备高亲和力，还要通过严格的动物实验和临床试验，通过安全性、药物动力学、疗效等多道关口的检验。所以获得足够多的高亲和力候选纳米抗体对于筛选纳米抗体药物至关重要。此外，基于噬菌体展示技术的纳米抗体制备技术周期过长，从制备文库到获得抗体通常需要4-5个月，噬菌体展示技术工艺复杂，成本较高，不易掌握。因此，迫切需要一种快速简单的纳米抗体制备技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种纳米抗体制备方法，是一种基于单个B细胞挑选的纳米抗体制备方法。本专利技术制备方法，通过以下方案实现：(1)制备并纯化目的抗原，并用该抗原免疫动物；(2)获得目的抗原免疫前和免疫后的动物外周血单个核细胞(PBMC)，并富集B细胞；(3)用FITC荧光标记抗原；(4)使用CloneMediaTM半固体培养基培养细胞，形成独立单个B细胞克隆；(5)挑选分泌阳性重链抗体的单个B细胞克隆；(6)提取阳性B细胞总RNA，逆转录成cDNA，并进行VHH片段扩增及测序；(7)纳米抗体的重组表达；(8)纳米抗体抗目的抗原的活性鉴定。所述步骤(1)包括将目的抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照6-7μg/kg剂量在动物背部皮下多点注射方式免疫动物，共免疫4次，每次间隔2周。所述目的抗原可以通过提取天然抗原获得，或者通过同源重组的方式，由真核或原核细胞表达提纯获得，或者通过其它方式获得。所述免疫动物为羊驼或骆驼属其它动物，或者鲨鱼。所述步骤(2)包括留取免疫前动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，用CD138抗体包被的免疫磁珠从PBMC中分选B细胞，将富集的B细胞置于细胞冻存液中，液氮保存备用。然后，用目的抗原免疫动物，于免疫程序结束时取动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，并富集B细胞。所述步骤(3)使用AlexaFluorTM488AntibodyLabelingKit试剂盒对步骤(1)中目的抗原进行绿色荧光标记。所述步骤(4)包括向CloneMediaTM半固体培养基添加步骤(3)所标记的目的抗原0.1-10μg/L、PE标记的抗动物IgG轻链抗体、R8482.5μg/mL和IL-21000U/mL等，混匀。加入富集的B细胞，细胞密度1000个/mL，混匀后铺6孔板，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中培养6天。所述步骤(5)包括将步骤(4)中培养的B细胞置于ClonePixTM细胞单克隆挑选仪器中，对培养的细胞进行拍照，再用ClonePixTMFLFusion分析软件分析单个B细胞克隆的平均荧光强度、克隆大小、克隆密集程度及克隆间距等，挑选平均荧光强度强、克隆大小适中、相对独立的单个B细胞克隆，置于96孔板中。所述步骤(6)包括用QiangenTMmiRNeasyMicroKit提取步骤(5)中挑选的单个B细胞克隆总RNA，并使用QiangenTMOneStepRT-PCRKit一步法扩增VHH片段，所用上下游引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。将扩增产物送测序公司进行基因测序。所述步骤(7)中表达载体pET30a(+)和VHH片段的酶切条件为：DNA1μg，10X缓冲液5μL，NotI和NedI酶各1μL，加水至50μL，37℃水浴20分钟后80℃灭活10分钟，跑胶后回收片段。载体与片段连接：载体50μg，片段40μg，T4连接酶1μL，10X缓冲液2μL，加水至20μL，室温1小时，转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，涂氨苄西林阳性培养板37℃培养过夜。挑选阳性克隆加入2mL含氨苄西林LB培养基37℃培养过夜，取1mL提取质粒进行双酶切鉴定。选取鉴定正确的克隆，按1：100将菌液稀释到含氨苄西林LB培养基中，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：/n(1)用目的抗原免疫动物；/n(2)获得目的抗原免疫前和免疫后的动物外周血单个核细胞(PBMC)，并富集B细胞；/n(3)用FITC荧光标记抗原；/n(4)使用CloneMedia

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)用目的抗原免疫动物；
(2)获得目的抗原免疫前和免疫后的动物外周血单个核细胞(PBMC)，并富集B细胞；
(3)用FITC荧光标记抗原；
(4)使用CloneMediaTM半固体培养基培养细胞，形成独立单个B细胞克隆；
(5)挑选分泌阳性重链抗体的单个B细胞克隆；
(6)提取阳性B细胞总RNA，逆转录成cDNA，并进行VHH片段扩增及测序；
(7)纳米抗体的重组表达；
(8)纳米抗体抗目的抗原的活性鉴定，用ELISA方法鉴定纯化的纳米抗体活性。


2.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(1)将目的抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照6-7μg/kg剂量在动物背部皮下多点注射方式免疫动物，共免疫4次，每次间隔2周。


3.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述目的抗原可以通过提取天然抗原获得，或者通过同源重组的方式，由真核或原核细胞表达提纯获得，或者通过其它方式获得。


4.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(2)取免疫前动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，用CD138抗体包被的免疫磁珠从PBMC中分选B细胞，将B细胞置于细胞冻存液中，液氮保存备用，用目的抗原免疫动物，于免疫程序结束时取动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，并富集B细胞。


5.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(3)使用AlexaFluorTM488AntibodyLabelingKit试剂盒对步骤(1)中目的抗原进行绿色荧光标记。


6.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，所述步骤(4)向CloneMediaTM半固体培养基添加步骤三所标记的目的抗原0.1-10μg/L、PE标记的抗动物IgG轻链抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冠华，靳昌忠，
申请(专利权)人：山东民康生物科技有限公司，杭州重链科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37