在抗体制造期间控制粉红色形成的方法技术

本发明专利技术是通过防止在制造和收获期间抗体的还原或抑制在制造和收获期间氰钴胺(CN‑Cbl)转化为羟钴胺(HO‑Cbl)来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。用红光替换细胞培养基制备和储存区域中的白光抑制CN‑Cbl向HO‑Cbl的转化。在收获时将过氧化物添加到澄清的物料中抑制抗体二硫键的还原。

Method of controlling pink formation during antibody manufacturing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在抗体制造期间控制粉红色形成的方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年5月9日提交的美国临时申请号62/503615的权益，将所述临时申请以其整体并入本文。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)治疗剂在多种人类疾病的治疗中变得更受欢迎。作为大分子，由于宽范围的翻译后修饰，mAb具有一定的异质性。成功控制制造过程对于确保治疗性蛋白质的产品质量和安全性以及批次之间的一致性是关键的。实际上，ICHQ6B指南要求产品外观规格。正常抗体制造通常具有一些可接受的颜色变化(DerfusGE等人,MAbs2014,6(3):679-688；PrenticeKM等人,MAbs2013,5(6):974-981；VijayasankaranN等人,BiotechnolProg2013,29(5):1270-1277；XuJ等人,ProcessBiochemistry2014,49:130-1394)。然而，由于过程中杂质而导致的颜色变化是缺乏过程控制的问题。最终原料药中粉红色/红色的主要来源之一已经被鉴定为维生素B12-mAb复合物(Derfus,2014；Prentice,2013)。尽管尚未阐明相互作用的性质，但是维生素B12与蛋白质的附着似乎足够牢固以使得通过多个下游纯化步骤(包括蛋白质A亲和色谱、低pH病毒灭活、各种精制色谱以及超滤和渗滤)进行共洗脱。抗体通常在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中产生，并且分泌到细胞外进入细胞培养基中。在培养过程结束时，在使用诸如离心、深度过滤或絮凝等方法澄清收获液的初步回收步骤期间，将细胞与培养基分离。在此过程期间，细胞经常经受各种压力，包括机械剪切、暴露于低溶解氧(DO)环境或温度和pH变化。这些压力导致细胞损伤，从而导致不希望的细胞内组分释放进入澄清液。这些胞质组分(如脂质和酶)可能潜在地影响产品质量，并且必须仔细监测或除去。例如，细胞内还原剂的释放可以导致抗体二硫键的还原(MunM.等人BiotechnolBioeng2015；112:734-742；RuaudelJ等人BMCProceedings2015；9(增刊9):第24页；MullanB等人BMCProc.2011；5(增刊8):第110页；Trexler-SchmidtM等人BiotechnolBioeng.2010；106:452-461；Koterba,KL等人JBiotechnol.2012；157:261-267；HandlogtenMW等人BiotechnolBioeng.2017；114:1469-1477；HutchinsonN等人BiotechnolBioeng.2006；95:483-491)。在制造过程期间，在收获操作和/或蛋白质A色谱后观察到抗体大量还原。多种过程参数可能对抗体还原的程度有影响。例如，在收获期间保持高水平的溶解氧(DO)对于保持抗体分子完整至关重要(MunM.2015；Trexler-SchmidtM,2010)。机械剪切力(其导致细胞裂解和细胞组分泄漏进入收获液中)也显著地导致还原(KaoYH等人BiotechnolBioeng.2010；107:622-632；HuttererKM等人MAbs.2013；5:608-613)。其他过程参数(如收获保持时间(ChungWK等人BiotechnolBioeng.2017；114:1264-12741)、培养基组分(如铜离子、半胱氨酸/半胱氨酸)以及pH和温度(Trexler-SchmidtM,2010；Chung,2017))也对二硫化物还原的程度有影响。为了确保抗体产品质量，制造过程中控制对于由抗体二硫键还原形成的低分子量(LMW)种类的控制是必要的。因此，近年来已经提出了几种控制二硫化物还原的策略。已经测试了化学抑制剂可防止抗体还原，包括收获前和收获后用抗还原剂(如硫酸铜)(ChaderjianWB等人BiotechnolProg.2005；21:550-553)、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫氧还蛋白抑制剂(美国专利号8,574,869)半胱氨酸、甲基蓝(WO2015/085003)和辅酶Q类似物(LiWW等人JAmChemSoc.2005；127:6140-614)处理。尽管历年来围绕缓解策略的知识和方法已经增加，但是在生产中这些方法的实施并非没有困难，如引入需要通过色谱步骤除去的化学副产物、处理时间增加和脱靶修饰或抗体产品损坏的风险。
技术实现思路
本专利技术是通过1)防止在制造和收获期间抗体的还原或2)抑制氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)或3)两者，防止在制造和收获期间抗体的还原和抑制氰钴胺转化为羟钴胺来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。在本专利技术的一个实施方案中，在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，通过防止培养基暴露于可见光来抑制CN-Cbl转化为HO-Cbl。在本专利技术的一个实施方案中，在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，仅使CN-Cbl暴露于UVA光。在本专利技术的一个实施方案中，在培养基制备、培养基储存期间和任选地在抗体生产和抗体收获期间，仅使CN-Cbl暴露于红光(>6000nm)。在本专利技术的一个实施方案中，在收获时通过将过氧化氢添加到澄清的物料中来防止抗体二硫键的还原。本专利技术的另一个实施方案是在制造期间抑制维生素B12与抗体结合的方法，其包括1)在制造和收获期间防止抗体二硫键的还原，或2)在细胞培养基制备、培养基储存、细胞培养过程或抗体收获期间抑制CN-Cbl向HO-Cbl的转化。本专利技术的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)在红光(>600nm)条件下制备和储存细胞培养基，2)在红光条件下培养产生目标抗体的细胞，3)在红光条件下从细胞培养物中收获抗体，以及4)将过氧化氢添加到收获溶液中。本专利技术的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)在红光(>600nm)条件下制备和储存细胞培养基，2)在红光条件下培养产生目标抗体的细胞，以及3)在红光条件下从细胞培养物中收获目标抗体。本专利技术的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)培养产生目标抗体的细胞，2)从细胞培养物中收获目标抗体，以及3)将过氧化氢添加到收获溶液中。附图说明图1A-图1D示出了维生素B12和两批mAbB的光谱吸收。1A是维生素B12和两批mAbB的吸收光谱。在PBS中的5mg/L的维生素B12(氰钴胺)(蓝线)，粉红色批次(红线)和无色批次(紫线)，从250nm到800nm。1B是(1A)的重缩放图，以显示详细信息。1D是一瓶具有可见的粉红色的mAbB的蛋白质A洗脱液。图2A-图2D显示维生素B12与抗体的附着是二级反应。(2A)将两批无色mAbA(未检测到还原的抗体分子的批次(“好”批次)和具有大部分还原的抗体的另一批次(“坏”批次))与CN-Cbl或HO-Cbl混合。孵育后，除去过量的游离维生素B12。样品从左到右，好批次和CN-Cbl；坏批次和CN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在抗体制造期间抑制粉红色形成的方法，其包括/na)防止抗体二硫键的还原，以及/nb)抑制培养基中的氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170509 US 62/503,6151.一种在抗体制造期间抑制粉红色形成的方法，其包括
a)防止抗体二硫键的还原，以及
b)抑制培养基中的氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，通过防止细胞培养基暴露于可见光来抑制CN-Cbl转化为HO-Cbl。


3.根据权利要求2所述的方法，其中在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，仅使CN-Cbl暴露于UVA光。


4.根据权利要求2所述的方法，其中在培养基制备、培养基储存期间和任选地在抗体生产和抗体收获期间，仅使CN-Cbl暴露于红光(>6000nm)。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在收获时通过将过氧化氢添加到澄清的物料中来防止抗体二硫键的还原。


6.根据权利要求5所述的方法，其中维持过氧化氢浓度≤10mM。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质选自抗体(Ab)、单克隆抗体(mAb)、人抗体(HuMAb)、人源化抗体和嵌合抗体。


8.一种在细胞培养物制造期间抑制维生素B12与抗体结合的方法，其包括
a)防止抗体二硫键的还原，或
b)抑制培养基中的氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)。


9.根据权利要求8所述的方法，其中在选自培养基制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜诚，A·U·博尔万卡尔，余骏昌，谭志俊，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US