一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体及其制备方法，本发明专利技术从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离到的淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列连接至PET‑30a载体，然后转化BL21感受态细胞，从转化后的单个菌落中筛选得到针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，采用ELISA试验对筛选得到的ScFv抗体进行初步活性鉴定，表明此抗体具有非洲猪瘟反应活性。本发明专利技术的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。

ScFv antibody against African swine fever virus and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanswinefeverVirus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起着至关重要的作用。抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。中国专利(公布号CN110078819A)一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法。该抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。该专利得到的抗体为禽源非洲猪瘟抗体，存在异源性反应，且没有克服常规抗体分子量较大的问题。单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。1988年，Bird和Huston等第一次将单链抗体研制出来，在此后的三十年里，科研人员对单链抗体的研究一直没有间断，不仅研制出了单链抗体多聚体、双特异性单链抗体等多种抗体形式，还建立了单链抗体的多种展示系统。单链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗体具有很好的穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。回顾近些年来抗体领域的发展情况，我们可以看出，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒特异性的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，所述ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术第二方面提供编码上述ScFv抗体的重链可变区的DNA片段和编码上述ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段。优选的，编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段如SEQIDNO:3所示，编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段如SEQIDNO:4所示。本专利技术第三方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段和编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段。本专利技术第四方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述重组表达载体。本专利技术第五方面，提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离：从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；(2)淋巴细胞总mRNA的提取：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；(3)全基因cDNA合成：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；(4)第一轮扩增：以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮扩增获得VH、VLλ和VLκ；(5)第二轮扩增：以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增获得VLλ-Linker、VH-Linker和VLκ-Linker；(6)第三轮扩增：以第二轮扩增产物为模板，进行第三轮扩增获得VH-VLκ13；(7)T-A克隆鉴定；(8)ScFv抗体的构建与制备：将测序正确的扩增产物构建的VH-VLκ13插入到PET-30a质粒中，构建重组质粒VH-VLκ13-PET-30a，然后将重组质粒转化入感受态细胞中，培养转化菌液并诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，既得抗非洲猪瘟ScFv抗体。优选的，以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，引物具体为：P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’，R1:5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’，F1:5’-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’，B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’，B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’，B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’。优选的，以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，引物具体为：P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’；F2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’；B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’。优选的，以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，引物具体为：P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；B13:5’-G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，其特征在于，所述ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，其特征在于，所述ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种编码如权利要求1所述ScFv抗体的DNA片段。


3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段如SEQIDNO:3所示，编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段如SEQIDNO:4所示。


4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含有如权利要求2所述的DNA片段。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求4所述的重组表达载体。


6.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
（2）淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤（1）分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
（3）全基因cDNA合成：
以步骤（2）提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
（4）第一轮扩增：
以步骤（3）合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮扩增获得VH、VLλ和VLκ；
（5）第二轮扩增：
以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增获得VLλ-Linker、VH-Linker和VLκ-Linker；
（6）第三轮扩增：
以第二轮扩增产物为模板，进行第三轮扩增获得VH-VLκ13；
（7）T-A克隆鉴定；
（8）ScFv抗体的构建与制备：
将测序正确的扩增产物构建的VH-VLκ13插入到PET-30a质粒中，构建重组质粒VH-VLκ13-PET-30a，然后将重组质粒转化入感受态细胞中，培养转化菌液并诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，既得抗非洲猪瘟ScFv抗体。


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【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，王丽娟，田宏，石正旺，罗俊聪，杨波，张克山，茹毅，李丹，杨帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62