一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，该方法通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。现有的技术中主要采用固相合成将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，但效果较差，收率偏低，为此，申请人通过大量的实验对如何将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽作了针对性地研究，发现采用通过氧化反应以及液相合成的方式可以一步将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，避免线性肽成环步骤在溶液中分两次进行，导致溶液中成分复杂，分离纯化难度大而且收率低，本技术方案采用氧化反应加液相合成的方式来合成具有两对二硫键的多肽是具有很高的创新性，是一项创造性成果。

A preparation method and kit for the synthesis of polypeptides containing two pairs of disulfide bonds, as well as the preparation method of procanapeptide

【技术实现步骤摘要】
一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法
本专利技术属于制药
，尤其是涉及一种通过对线性肽进行氧化反应，将其液相合成为具有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒。
技术介绍
普利卡那肽是一种鸟苷酸环化酶C(GC-C)受体激动剂，其治疗机理与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力。普利卡那肽为一类新的口服制剂，无需注射就可以直接口服用药，可为众多患者接受。这类制剂模仿利钠肽Uroguanylin的作用，诱导肠液分泌的胃肠道进入管腔。其作为一种可模拟胃肠液体调节肽效应的新药，对成人慢性特发性便秘的客观指标和患者自评转归有效。但是，普利卡那肽的制备方法目前在国际上仍属空白，至今尚无适合大规模生产且收率高、杂质含量低的普利卡那肽的制备方法报道。如深圳翰宇药业首先报道的普利卡那肽的制备方法(专利号为CN103694320A)，采用了固相合成线性多肽，然后在溶液中分两步分别成环得到。由于该方法成环在溶液中分两次进行，溶液中成分复杂，分离纯化难度较大，收率较低。随后，南京工业大学报道了另一种合成普利卡那肽的方法(专利号为CN104628827A)，采用Fmoc固相合成路线，先合成线性肽，然后在树脂上定向氧化形成两对二硫键，最后切割纯化后直接得到普利卡那肽，而上述方案由于在固相上合成两对二硫键，收率同样不高。因此，急需提供一种合成条件温和、工艺简单、具有高收率的用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法，该方法工艺简单、稳定并且具有相对高的收率。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。应理解所述线性肽为内部没有成环的多肽。需要说明的是，现有的技术中主要是采用固相氧化合成为具有两对二硫键的多肽，但效果较差，收率偏低，在专利号为CN103694320A的专利中，提到了其产物的收率只有30％左右，为此，申请人通过大量的实验对如何将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽作了针对性地研究，发现采用通过氧化反应以及液相合成的方式可以一步将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，避免线性肽成环步骤在溶液中分两次进行，导致溶液中成分复杂，分离纯化难度大而且收率低，本技术方案采用氧化反应加液相合成的方式来合成具有两对二硫键的多肽是具有很高的创新性，是一项创造性成果。通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，加入氧化剂；优选的，所述氧化剂为DHS以及NCS，最优为DHS；优选地，所述氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g；更加优选的，当氧化剂为DHS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g；更加优选的，当氧化剂为NCS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g。经过申请人大量的实验验证，与其它氧化剂(双氧水、空气、二甲亚砜等氧化剂)相比，氧化剂为DHS、NCS时技术效果相对较好，具有相对高的收率。优选的，所述线性肽具有四个(两对)Cys，每两个Cys通过氧化反应形成一对二硫键，更加优选的，线性肽中的4个Cys同时通过氧化反应形成两对二硫键。对于线性普利卡那肽来说，本方案通过氧化反应使得4位的Cys与12位的Cys形成一对二硫键，7位的Cys与15位的Cys形成一对二硫键。应理解除了线性普利卡那胎之外的线性肽也可以通过相同方法制备两对二硫键。通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，依次加入纯化水、变性剂、pH调节剂，然后加入稳定剂、氧化剂，接着降低温度，最后加入线性肽进行反应得到具有两对二硫键的多肽；优选的，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份，优选为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份；优选的，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿中的一种或多种；更加优选的，所述变性剂为盐酸胍；优选的，pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种；更加优选的，PH调节剂为碳酸氢钠；优选的，稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇其中的一种或多种；更加优选的，稳定剂为乙二醇；优选的，温度降低为-25至-30℃，更加优选的，温度降低到-10℃至-15℃；优选的，反应时的PH值为7.5-13，更加优选为9-11，最好为10。更加优选的，在通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽之前，还包括通过裂解含有线性肽的树脂制得线性肽；或通过氨基酸液相合成制得线性肽。应理解除了上述两种方式制备得到的线性肽外，通过购买商业化的线性肽来合成具有两对二硫键的多肽的方式也应纳入到本申请的保护范围内。所述含有线性肽的树脂通过树脂逐一偶联氨基酸制得；应理解在偶联氨基酸时，氨基酸上优选是具有保护基。优选的，所述含有线性肽的树脂通过在固相树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys15、Gly、Thr、Cys12、Ala、Val、Asn、Val、Cys7、Leu、Glu、Cys4、Glu、Asp、Asn制备得到。优选的，所述多肽为普利卡那肽，所述线性肽为线性普利卡那肽。应理解本申请可用于其它线性肽合成具有两对二硫键的多肽，不仅限于将线性普利卡那肽合成为普利卡那肽。一种用于合成含有两对二硫键的多肽的试剂盒，包括，纯化水、变性剂、pH调节剂、稳定剂、氧化剂以及线性肽；优选的，所述氧化剂为DHS以及NCS，最优为DHS；优选的，所述线性肽为线性普利卡那肽；优选的，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份，优选为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份；优选的，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿中的一种或多种；更加优选的，所述变性剂为盐酸胍；优选的，pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种；更加优选的，PH调节剂为碳酸氢钠；优选的，稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇其中的一种或多种；更加优选的，稳定剂为乙二醇。优选的，温度降低为-25至-30℃，更加优选的，温度降低到-10℃至-15。优选的，反应时的PH值为7.5-13，更加优选为9-11，最好为10。一种普利卡那肽的制备方法，包括以下步骤：S1：在树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys15、Gly、Thr、Cys12、Ala、Val、Asn、Val、Cys7、Leu、Glu、Cys4、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂；...

【技术保护点】
1.一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。


2.根据权利要求1所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，加入氧化剂；
优选的，所述氧化剂为DHS以及NCS，最好为DHS；
优选地，所述氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g；
更加优选的，当氧化剂为DHS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g；
更加优选的，当氧化剂为NCS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g。


3.根据权利要求1所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，所述线性肽具有四个Cys，每两个Cys通过氧化反应形成一对二硫键，优选的，线性肽中的两对Cys同时通过氧化反应形成两对二硫键。


4.根据权利要求2所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，加入纯化水、变性剂、pH调节剂，然后加入稳定剂、氧化剂，接着降低温度，最后加入线性肽进行反应得到具有两对二硫键的多肽；
优选的，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份，优选为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份；
更加优选的，所述氧化剂为DHS时，DHS与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为(1-20)：1；最优为(5-15)：1；
更加优选的，所述氧化剂为NCS时，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的摩尔比为(1-20)：1；最优为(5-15)：1；
优选的，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿中的一种或多种；更加优选的，所述变性剂为盐酸胍；
优选的，pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种；更加优选的，PH调节剂为碳酸氢钠；
优选的，稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇其中的一种或多种；更加优选的，稳定剂为乙二醇；
优选的，温度降低为-25至-30℃，更加优选的，温度降低到-10℃至-15℃；优选的，反应时的PH值为7.5-13，更加优选为9-11，最好为10。


5.根据权利要求1所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，还包括通过裂解含有线性肽的树脂制得线性肽；
或通过氨基酸液相合成制得线性肽。


6.根据权利要求5所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，所述含有线性肽的树脂通过树脂逐一偶联氨基酸制得；
优选的，所述含有线性肽的树脂通过在固相树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys15、Gly、Thr、Cys12、Ala、Val、Asn、Val、Cys7、Leu、Glu、Cys4、Glu、Asp、Asn制备得到。


7.根据权利要求1-6任一项所述的一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学明，江峰，林欣媛，宓鹏程，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44