一种改善生物活性蛋白性质的载体蛋白制造技术

本文提供一种用于改善生物活性蛋白的性质的载体蛋白，该载体蛋白的结构为G‑X‑Y三元重复结构，其中G为甘氨酸，X和Y各自独立选自脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸。本文还提供含有该载体蛋白和生物活性蛋白的融合蛋白。本文的融合蛋白具有改善的生物学性质，例如改善的药代动力学和理化性质。

A carrier protein for improving the properties of bioactive proteins

【技术实现步骤摘要】
一种改善生物活性蛋白性质的载体蛋白
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种可以改善活性蛋白性质的载体蛋白。
技术介绍
众所周知，分子量小于70kDa的蛋白质或多肽容易通过肾过滤而被体内清除(JevsevarS,KunsteljM,PorekarVG，PEGylationoftherapeuticproteins，BiotechnolJ.，5:113–28，2010)。因此，一般采用融合或交联分子量较大的载体蛋白、聚乙二醇(PEG)、脂肪酸等来增加其表观分子量和流体动力学半径，从而降低其肾小球滤过率(KontermannRE，Strategiestoextendplasmahalf-livesofrecombinantantibodies，BioDrugs，23:93–109；2009；KangJS等，EmergingPEGylateddrugs.ExpertOpinEmergDrugs.，14:363–80，2009)，并最终达到延长蛋白或多肽体内半衰期的目的。用作交联使用的载体一般是PEG或脂肪酸等，而人血清白蛋白、免疫球蛋白Fc片段、转铁蛋白等则普遍用于重组融合，并且大都有对应的成功上市药物。近年来，新型的重组融合载体蛋白不断涌现(WRStrohl，FusionProteinsforHalf-LifeExtensionofBiologicsasaStrategytoMakeBiobetters，Biodrugs，2015,29(4):215-39)，如URP(中国专利ZL200780015899.2)、XTEN(中国专利申请CN201080011467.6；VolkerSchellenberger等，Arecombinantpolypeptideextendstheinvivohalf-lifeofpeptidesandproteinsinatunablemanner.NatureBiotechnology27(12):1186，2009)、类弹性蛋白ELP(MacEwanSR,ChilkotiA.,Applicationsofelastin-likepolypeptidesindrugdelivery.JControlRelease.2014；190:314-30.)、PAS(专利号ZL200880019017，MSchlapschy等，PASylation:abiologicalalternativetoPEGylationforextendingtheplasmahalf-lifeofpharmaceuticallyactiveproteins.ProteinEngineeringDesign&SelectionPeds.2013,26(8):489-501)和GLK(中国专利号200980103870.9)等。其中XTEN和ELP融合制备的蛋白药物已经用于临床试验中(YuenKC等，Along-actinghumangrowthhormonewithdelayedclearance(VRS-317):resultsofadouble-blind,placebo-controlled,singleascendingdosestudyingrowthhormone-deficientadults,JClinEndocrinolMetab.,98(6):2595-603.2013；ChristiansenM等，WeeklySubcutaneousDosesofGlymera(PB1023)aNovelGLP-1AnalogueReduceGlucoseExposureDoseDependently，http://phasebio.com/)。这些人工设计的非天然蛋白质，在跟某些活性蛋白或多肽通过重组表达或者交联后形成的融合蛋白或产物，相比于单独的活性蛋白和多肽，显著地提高了血清稳定性并延长了其体内半衰期，最终改善了治疗效果。专利号为ZL200780015899.2的中国专利公开了一种非结构化重组聚合物(URP)，其基本不能非特异性结合血清蛋白，其特征在于：(a)含有至少100个毗连氨基酸；(b)所述URP中所含的甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基之和占所述URP中全部氨基酸的约80％以上；(c)经Chou-Fasman算法测定，所述URP序列的至少50％氨基酸不形成二级结构；(d)所述URP的T表位评分小于-4。申请号为CN201080011467.6的中国专利申请公开了一种分离的延伸重组多肽(XTEN)，包含超过大约400至大约3000个氨基酸残基，其中该XTEN的特征在于：(a)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和占XTEN的总氨基酸序列的超过大约80％；(b)该XTEN序列基本是非重复的；(c)当通过TEPITOPE算法分析时，该XTEN序列缺乏预测的T细胞表位，其中对XTEN序列内表位的TEPITOPE算法预测是基于-9或更高的得分；(d)通过GOR算法确定，该XTEN序列具有超过90％的无规卷曲形成；和(e)通过Chou-Fasman算法确定，该XTEN序列具有少于2％的α螺旋和少于2％的β-折叠。专利号为ZL200880019017的中国专利公开了包含至少两个结构域的生物学活性蛋白，其中：(a)所述至少两个结构域的第一结构域包含具有和/或介导所述生物学活性的氨基酸序列；以及(b)所述至少两个结构域的第二结构域包含形成无规卷曲构象的由至少10个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中所述第二结构域由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基组成，其中所述无规卷曲构象介导所述生物学活性蛋白体内和/或体外稳定性的增加。类弹性蛋白ELP是由(VPGXG)n组成，其中X可以是除脯氨酸(Pro)之外的任意氨基酸。n的数目不固定，ELP有在特定温度(跨度为2-3℃)下状态会发生急剧转变的特性：低于这一温度，ELP呈可溶状态；高于这一温度，ELP会发生快速聚集成微米级肉眼可见的颗粒物；再次降低温度，ELP又会重新溶解；这一温度称之为反向转换温度，简称相变温度(Tt)。ELP属于弹性蛋白，具有生物降解性和非免疫原性，因此适用于作为延长药物半衰期的融合蛋白使用。专利号为ZL200980103870.9的中国专利公开了一种用于延长蛋白体内半衰期的重组明胶样单元(GLK)，其特征在于，所述的明胶样单元是结构如下的多肽：(Gly-X-Y)n，式中，Gly为甘氨酸残基；X和Y分别为20种天然氨基酸除了Cys之外的任意氨基酸残基，以及Hyp；n为20-300；并且，所述的明胶样单元具有以下特征：(a)所述明胶样单元中以下亲水性氨基酸Asn，Asp，Gln，Glu，Lys，Pro，Ser，Hyp，Arg的氨基酸百分比含量总和为40％至2/3；(b)所述明胶样单元中，Pro和Hyp的数量之和与n的比值≥0.6；(c)Gly的数量之和与n的比值≤1.15；且，根据ProtParam公式计算，代表亲水性的GRAV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类明胶单元，具有以下重复结构：/n(G-X-Y)

【技术特征摘要】
1.一种类明胶单元，具有以下重复结构：
(G-X-Y)n
其中，G为甘氨酸，X和Y各自独立选自脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸；n为5-20的整数，优选n为6-20或9-15的整数。


2.如权利要求1所述的类明胶单元，其特征在于，所述类明胶单元由选自以下的两种或两种以上的G-X-Y三元单体重复结构组成：GPP、GEE、GAA、GEA、GAE、GAP、GPA、GPE和GEP。


3.如权利要求1所述的类明胶单元，其特征在于，所述类明胶单元选自SEQIDNO:17-89中任一奇数编号的序列所示的类明胶单元。


4.一种类明胶蛋白，其特征在于，所述类明胶蛋白的核心结构为：U1-U2或U1-U2-…Ua，其中，U1、U2、…、Ua各自代表权利要求1-3中任一项所述的任意一种类明胶单元，a为≥3的整数，且所述类明胶单元相同或不同。


5.如权利要求4所述的类明胶蛋白，其特征在于，所述核心结构的氨基酸残基总数占该类明胶蛋白氨基酸残基总数的70％以上，较佳80％以上，更佳85％以上，进一步更佳90％以上、95％以上或99％以上。


6.如权利要求4或5所述的类明胶蛋白，其特征在于，
所述类明胶蛋白中，丙氨酸的含量大于等于10％；和/或
所述类明胶单元中，代表亲水性的GRAVY值大于-1.1。


7.如权利要求6所述的类明胶蛋白，其特征在于，
所述类明胶蛋白中，丙氨酸的含量在10-45％的范围内；和/或
所述类明胶蛋白中，代表亲水性的GRAVY值小于等于0。


8.如权利要求4-7中任一项所述的类明胶蛋白，其特征在于，所述类明胶蛋白具有100-2000个氨基酸。


9.如权利要求4-8中任一项所述的类明胶蛋白，其特征在于，
所述类明胶蛋白的凝冻强度≤10g；和/或
所述类明胶蛋白的粘度≤3mPa·s。


10.如权利要求4所述的类明胶蛋白，其特征在于，所述类明胶蛋白的氨基酸序列选自：
(1)SEQIDNO:91-185中任一奇数编号所示的氨基酸序列；
(2)含两条或两条以上(1)所述的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(3)与(1)或(2)所述的氨基酸序列具有80％以上同一性百分比、优选85％以上同一性百分比、更优选90％以上同一性百分比、更优选95％以上同一性百分比的氨基酸序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：黄岩山，
申请(专利权)人：浙江道尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33