本发明专利技术公开了一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3‑氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存，通过对固定化细胞生物转化生产烟酰胺的研究，固定化细胞重复利用次数从3次提高到6‑7次，转化率达99.6％，而且，通过对烟酰胺的提取工艺的改进，使其结晶收率达88.6％，总提取收率88.5％，本发明专利技术以3‑氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，解决了传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。
【技术实现步骤摘要】
一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺
本专利技术涉及生物化工
，具体为一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺。
技术介绍
烟酰胺是一种水溶性的维生素B3的衍生物，在生物氧化呼吸链中起着传递氢原子的作用，可以促进生物氧化和组织的新陈代谢，对维持皮肤、消化道和神经系统的完整性具有重要作用。此外，烟酰胺可作为饲料中的添加剂、医药中间体和在食品中作为营养强化剂来预防糙皮病和心血管疾病，当今社会十分重要的一种食品添加剂。目前，烟酰胺合成工艺主要分为三步：1)环化将链式有机物分子环化成一个含有甲基的吡啶环；2)甲基氧化将含有甲基的吡啶环上的甲基氧化为氰基，得氰基吡啶；3)将3-氰基吡啶上的氰基水解为酰胺基，其中第三步3-氰基吡啶水解主要有化学法和微生化法，此外3-氰基吡啶也有用氨水在加压的条件下进行水解也能得到烟酰胺。但传统的化学法高温高压，能耗较大，且在分离提取的时候需要溶剂类的萃取剂介入，在后续的分离过程有溶剂残留的影响。生物法是用氰基吡啶在菌种的存在下，进行反应得到烟酰胺，微生物法虽然产品纯度高，但为间歇生产工艺且操作条件复杂不易控制，从而影响反应和产品质量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，以3-氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，以解决上述
技术介绍
中提出的传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括以下步骤：S1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO40.05g/l，K2HPO40.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC10.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；S2：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/LHCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量；S3：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重；S4：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。更进一步地，S2中磷酸缓冲液的pH＝7.5。更进一步地，在S2的反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位U。更进一步地，S2中烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟酸生成量外，其他测定条件同3-氰基吡啶水合酶活力的测定，在1分钟内催化水解烟酰胺生成1.0μmol烟酸所需的酶量定义为烟酰胺水解酶的一个活力单位。更进一步地，S4中为了能够更好的使含烟腈水合酶转化烟腈生产烟酰胺，还提供如下步骤：S401：先离心得固定化细胞，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的细胞悬浮液，按比例加入一定量的海藻酸钠，经搅拌混匀后得粘稠状液体；S402：用注射器将粘稠状液体注入含一定量的CaCl2水溶液中得小球状的固定化细胞颗粒，将细胞颗粒在一定的低温下硬化10多小时，过滤后得生产用的能转化底物烟腈的固定化细胞；S403：在10℃温度下，往含固定化细胞的液体中分批加入底物烟腈，固定化细胞将烟腈生物催化成烟酰胺；S404：用HPLC法测烟腈、烟酰胺的含量，当烟腈含量低于0.1％时终止生物催化，将转化液过滤后得含烟酰胺溶液，再经冷却结晶得成品。更进一步地，S4中湿烟酰胺具体提取方法为：将转化液放入烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时，溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠，中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶，随后停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱于85℃烘干即可得成品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存，通过对固定化细胞生物转化生产烟酰胺的研究，固定化细胞重复利用次数从3次提高到6-7次，转化率达99.6％，而且，通过对烟酰胺的提取工艺的改进，使其结晶收率达88.6％，总提取收率88.5％，本专利技术以3-氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，解决了传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。附图说明图1为本专利技术的工艺流程图；图2为本专利技术的烟酰胺提取方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1，本专利技术实施例中：一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括以下步骤：第一步：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO40.05g/l，K2HPO40.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC10.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；。第二步：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/LHCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量。其中，磷酸缓冲液的pH＝7.5，在反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位(U)；烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO
【技术特征摘要】
1.一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO40.05g/l，K2HPO40.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC10.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；
S2：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/LHCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量；
S3：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重；
S4：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。
2.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S2中磷酸缓冲液的pH＝7.5。
3.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，在S2的反应条件下，1分钟内催...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓路，史玉龙，王丹，吴宗明，韩道平，夏华跃，
申请(专利权)人：安徽瑞邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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