一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，其包括将马肌肉块灭菌、清除脂肪组织和结缔组织后，粉碎成块状肌肉组织；将所述块状肌肉组织经胰蛋白酶消化后，离心分离得到第一上清液和第一沉淀物；将所述第一上清液离心，得到第二上清液和第二沉淀物，弃所述第二上清液，将所述第二沉淀物用增殖培养液重悬、离心后，得到第三上清液和第三沉淀物，弃所述第三上清液，将所述第三沉淀物增殖培养液悬浮，过细胞过滤器，收集第一滤液，将所述第一滤液离心后，得到第四沉淀物。本发明专利技术实施例通过纯化提高骨骼肌卫星细胞的数量和纯度，为研究肌肉生长、肌肉损伤等科研院校提供了一种准确的骨骼肌卫星细胞的分离培养方法。

A method of isolation and culture of horse skeletal muscle satellite cells

【技术实现步骤摘要】
一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法
本专利技术实施例涉及细胞培养
，具体涉及一种马的骨骼肌卫星细胞的培养体系。
技术介绍
目前，赛马和娱乐用马是未来马产业发展的主流，而马在运动过程中肌肉会根据运动量的大小受到不同程度的损伤，使马的运动性能受到影响，而在赛马和马术运动中马具有良好的运动性能是必要的条件。骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有增殖、分化的肌源性干细胞，在骨骼肌再生过程中起着不可或缺的作用，骨骼肌卫星细胞在机体成年后大部分是静止的，只会在组织受到损伤时，才会被激活进行增殖、分化，促进肌纤维的修复。骨骼肌卫星细胞是用于研究肌肉生长发育，损伤与修复，与肌肉相关的疾病等方面的重要细胞模型。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，以解决现有技术中的缺乏有效对马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，其包括将马肌肉块灭菌、清除脂肪组织和结缔组织后，粉碎成块状肌肉组织；将所述块状肌肉组织经胰蛋白酶消化后，离心分离得到第一上清液和第一沉淀物；将所述第一上清液离心，得到第二上清液和第二沉淀物，弃所述第二上清液，将所述第二沉淀物用增殖培养液重悬、离心后，得到第三上清液和第三沉淀物，弃所述第三上清液，将所述第三沉淀物增殖培养液悬浮，过细胞过滤器，收集第一滤液，将所述第一滤液离心后，得到第四沉淀物；将所述第一沉淀物经过胶原酶消化处理后，过细胞过滤器，得到第二滤液，将所述第二滤液离心后，得到第四上清液和第五沉淀物，将所述第四上清液进一步离心得到第六沉淀物，将所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培养液悬浮，离心后得到第五上清液和第七沉淀物；将所述第四沉淀物悬浮液和和第七沉淀物悬浮液混合，离心，得到第六上清液和第八沉淀物；所述第八沉淀物用增殖培养液悬浮，经细胞过滤器过滤后，得到第三滤液，将所述第三滤液离心，得到第九沉淀物马骨骼肌卫星细胞；将所述第九沉淀物用增殖培养液悬浮，培养，通过差速贴壁法纯化得到纯化的马骨骼肌卫星细胞。优选的，所述马肌肉块灭菌采用70％乙醇浸泡灭菌。优选的，所述马肌肉块粉碎前，用含有青霉素链霉素的DPBS冲洗所述马肌肉块直至DPBS澄清无血色。优选的，所述胰蛋白酶的质量分数为0.25％。优选的，所述离心过程为700rpm-2000rpm，离心时间为5-15min。优选的，所述第一滤液、第二滤液均采用70μm细胞过滤器，所述第三滤液采用40μm过滤器。优选的，所述增殖培养液包括以下质量分数的原料：20％胎牛血清，1％青霉素链霉素和两性霉素B以及余量的DMEM。优选的，所述胶原酶为Ⅳ型胶原酶，其通过DMEM稀释浓度至1mg/1mL。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术实施例建立马骨骼肌卫星细胞的培养体系及方法，分离出来成梭形，且生长状态良好，可以正常增殖传代的马骨骼肌卫星细胞。本专利技术实施例通过增加多次离心和清洗的步骤使得到的原代细胞干净无菌，并且通过差速贴壁法去除杂质、细胞碎片、成纤维细胞等来纯化马骨骼肌卫星细胞。本专利技术实施例通过纯化提高骨骼肌卫星细胞的数量和纯度，为研究肌肉生长、肌肉损伤等科研院校提供了一种准确的骨骼肌卫星细胞的获取方法，为骨骼肌卫星细胞用于肌肉的再生和损伤修复提供有利条件和研究基础，具有巨大的科研和社会价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1为本专利技术实施例提供的原代培养的骨骼肌卫星细胞显微镜图，其中，A：分离第1天的肌卫星细胞；B：原代第3天的肌卫星细胞；C：原代第5天的肌卫星细胞；D：原代第7天的肌卫星细胞；图2为本专利技术实施例提供的未分化与分化的肌卫星细胞图，其中，A：分化前达到80％汇合的肌卫星细胞；B：分化后产生肌管；图3为本专利技术实施例提供的差速贴壁法鉴定骨骼肌卫星细胞图，其中，A：成纤维细胞贴壁1h；B：成纤维细胞贴壁4h；C：成纤维细胞贴壁8h；D：骨骼肌卫星细胞贴壁1h；E：骨骼肌卫星细胞贴壁4h；F：骨骼肌卫星细胞贴壁8h；图4为本专利技术实施例提供的RT-PCR产物鉴定肌卫星细胞电泳图，其中，M:maker，泳道1：GAPDH，泳道2：Pax7，泳道3：Myod，泳道4：Desmin；图5为本发麻实施例提供的免疫荧光鉴定肌卫星细胞图，其中，A，D，G为肌卫星细胞Hoechst核染；B：Pax7阳性表达；E：Myod阳性表达；H：desmin阳性表达；C,F,I为Merged图。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中，Ⅳ型胶原酶的配置浓度为：1mg/1mL，用DMEM稀释并经0.22μm过滤器过滤。本专利技术实施例中，增殖培养液的配置方法为：20％胎牛血清(FBS)，1％青霉素链霉素和两性霉素B，DMEM补充，并经0.22μm过滤器过滤。本专利技术实施例中，分化培养液的配置方法为：2％马血清，1％青霉素链霉素，余量用DMEM补充，并经0.22μm过滤器过滤。本专利技术实施例中，DMEM购自gibco公司货号2066482。本专利技术实施例中，DPBS购自gibco公司货号2043115，DPBS为袋装粉末状，每袋的DPBS溶于1L的蒸馏水内，由此配制成DPBS溶液。本专利技术实施例中所采用的仪器如下：TD6A-WS台式离心机、HWS-26型电热恒温水浴锅、ThermoScientificHERAcell150iCO2培养箱、ZEISS倒置相差显微镜、CFX96实时荧光定量PCR仪器、Bio-Rad凝胶成像系统、ECHOrevolveFL荧光显微镜实施例1、马骨骼肌卫星细胞的分离培养本专利技术实施例的马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法包括以下步骤：1、采集2岁的马匹的肌肉，在培养皿中用70％乙醇快速将马肌肉浸泡灭菌，将灭菌后的肌肉样品立即转移到含有青霉素链霉素的DPBS的新培养皿中，并用3倍体积的DPBS冲洗直至DPBS澄清无血色。其中，DPBS要提前加入1％青霉素链霉素并经0.22μm过滤器过滤。2、将冲洗后的马肌肉块上可见的脂肪和结缔组织用手术刀去除，在含有DMEM的培养皿中用剪刀切碎块状马肌肉组织，并将该肌肉组织剪碎至1mm3大小。将剪碎后的肌肉组织转移到15mL离心管内，1000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，其特征在于包括将马肌肉块灭菌、清除脂肪组织和结缔组织后，粉碎成块状肌肉组织；/n将所述块状肌肉组织经胰蛋白酶消化后，离心分离得到第一上清液和第一沉淀物；/n将所述第一上清液离心，得到第二上清液和第二沉淀物，弃所述第二上清液，将所述第二沉淀物用增殖培养液重悬、离心后，得到第三上清液和第三沉淀物，弃所述第三上清液，将所述第三沉淀物增殖培养液悬浮，过细胞过滤器，收集第一滤液，将所述第一滤液离心后，得到第四沉淀物；/n将所述第一沉淀物经过胶原酶消化处理后，过细胞过滤器，得到第二滤液，将所述第二滤液离心后，得到第四上清液和第五沉淀物，将所述第四上清液进一步离心得到第六沉淀物，将所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培养液悬浮，离心后得到第五上清液和第七沉淀物；/n将所述第四沉淀物悬浮液和和第七沉淀物悬浮液混合，离心，得到第六上清液和第八沉淀物；/n所述第八沉淀物用增殖培养液悬浮，经细胞过滤器过滤后，得到第三滤液，将所述第三滤液离心，得到第九沉淀物马骨骼肌卫星细胞；/n将所述第九沉淀物用增殖培养液悬浮，培养，通过差速贴壁法纯化得到纯化的马骨骼肌卫星细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.一种马骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，其特征在于包括将马肌肉块灭菌、清除脂肪组织和结缔组织后，粉碎成块状肌肉组织；
将所述块状肌肉组织经胰蛋白酶消化后，离心分离得到第一上清液和第一沉淀物；
将所述第一上清液离心，得到第二上清液和第二沉淀物，弃所述第二上清液，将所述第二沉淀物用增殖培养液重悬、离心后，得到第三上清液和第三沉淀物，弃所述第三上清液，将所述第三沉淀物增殖培养液悬浮，过细胞过滤器，收集第一滤液，将所述第一滤液离心后，得到第四沉淀物；
将所述第一沉淀物经过胶原酶消化处理后，过细胞过滤器，得到第二滤液，将所述第二滤液离心后，得到第四上清液和第五沉淀物，将所述第四上清液进一步离心得到第六沉淀物，将所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培养液悬浮，离心后得到第五上清液和第七沉淀物；
将所述第四沉淀物悬浮液和和第七沉淀物悬浮液混合，离心，得到第六上清液和第八沉淀物；
所述第八沉淀物用增殖培养液悬浮，经细胞过滤器过滤后，得到第三滤液，将所述第三滤液离心，得到第九沉淀物马骨骼肌卫星细胞；
将所述第九沉淀物用增殖培养液悬浮，培养，通过差速贴壁法纯化得到纯化的马骨骼肌卫星细胞。


2.如权利要求1所述的马骨骼肌卫星细胞的分离培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：格日乐其木格，赵雅丽，张心壮，才文道力玛，曹迪，纳日嘎，芒来，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙;15