miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用制造技术

本发明专利技术公开了一种非编码小RNA miR-192在抑制绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖中的应用，将非编码小RNA miR-192的类似物转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内造成细胞内miR-192的过量表达，过表达miR-192的绵羊骨骼肌卫星细胞与过表达对照核苷酸序列的细胞相比，绵羊骨骼肌卫星细胞分化受到抑制，但增殖能力得到提高。本发明专利技术还提供miR-192在绵羊骨骼肌卫星细胞内抑制RB1蛋白水平表达的应用。本发明专利技术首次发现了miR-192具有负调控绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用。
技术介绍
骨骼肌卫星细胞是一种称体肌源性干细胞，负责动物骨骼肌损伤后的再生,是一种研究骨骼肌生发育的体外模型。当骨骼肌遭遇损伤后，骨骼肌卫星细胞能迅速启动修复程序，在很短时间内可融合为新的肌管,或融合到损伤的肌纤维中修复肌肉组织。在发育生物学中，骨骼肌损伤后的再生过程被认为同骨骼肌的发育过程非常相似，而骨骼肌卫星细胞负责动物骨骼肌损伤后的再生，因此，骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，进而更加深入研究骨骼肌的生长发育过程。绵羊作为一种重要的家养动物，其产肉量和肉品质一直是人们关注的热点。解析绵羊骨骼肌生长发育的生物学机理，可为提高其产肉量和肉品质提供科学依据。虽然miR-192已被发现参与了癌细胞的发生，但其在骨骼肌卫星细胞成肌分化和增殖中的作用尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供miR-192序列在对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用。miR-192序列，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:1所示。在绵羊骨骼肌卫星细胞中，所述的miR-192序列在抑制成肌分化中的应用。在绵羊骨骼肌卫星细胞中，所述的miR-192序列在促进增殖中的应用。所述的miR-192序列在抑制RB1基因的蛋白水平表达中的应用。本专利技术所述的应用，其中，所述的miR-192序列在绵羊骨骼肌卫星细胞内通过结合靶向RB1基因的3’非编码区来抑制RB1基因的表达。本专利技术所述的miR-192序列对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控检测方法，包括如下步骤：(1)在绵羊骨骼肌卫星细胞中转染miR-192类似物，实现细胞内miR-192的过表达，设置对照组，诱导绵羊骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，利用免疫荧光检测细胞肌管形成情况；同时检测对照组及实验组的绵羊骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达水平；(2)利用刮伤-愈合的方法检测过表达miR-192后的绵羊骨骼肌卫星细胞在细胞增殖迁移上是否受到影响，首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达；待细胞继续生长48h，用1ml移液枪枪头，在培养皿上刮一下，造成刮后伤痕，更换低浓度血清培养基后继续培养24h，观察愈合情况。本专利技术的应用的有益效果：骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，进而更加深入研究骨骼肌的生长发育过程，绵羊作为一种重要的家养动物，其产肉量和肉品质一直是人们关注的热点，解析绵羊骨骼肌生长发育的生物学机理，可为提高其产肉量和肉品质提供科学依据。因此，本专利技术的研究显得尤为重要。本专利技术提供了一种非编码小RNAmiR-192在抑制绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖中的应用，其是将非编码小RNAmiR-192的类似物转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内造成细胞内miR-192的过量表达，过表达miR-192的绵羊骨骼肌卫星细胞与过表达对照核苷酸序列的细胞相比，绵羊骨骼肌卫星细胞分化受到抑制，但增殖能力得到提高。本专利技术还提供miR-192在绵羊骨骼肌卫星细胞内抑制RB1蛋白水平表达的应用。miR-192在细胞内通过靶向RB13’非编码区抑制基因表达的应用，miR-192可在细胞内靶向RB13’非编码区中特定的一段序列抑制荧光素酶的表达。本专利技术首次发现了miR-192具有负调控绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的功能。下面结合附图对本专利技术的miR-192序列的应用作进一步说明。附图说明图1为本专利技术中转染miR-192类似物和对照(NC)后对绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响结果；(右下角标尺代表100μm)；图2为本专利技术中转染miR-192类似物和对照(NC)后对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的影响结果；图3为本专利技术中转染miR-192类似物和对照后，诱导分化84h，收集细胞，提取RNA。RT-qPCR检测肌球蛋白重链(myosinheavychain,MHC)表达情况；图4为本专利技术中转染miR-192类似物和对照后，诱导分化84h，收集细胞，提取RNA。RT-qPCR检测myogenin(MyoG)的表达情况；图5为本专利技术中miR-192与RB13’非编码区内预测位点的相互作用示意图；图6为本专利技术中miR-192对RB1蛋白水平影响的检测结果；图7为本专利技术中检测是否成功构建载体的琼脂糖凝胶电泳图；图8为本专利技术中双荧光素酶试验结果图。具体实施方式实施例1miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化的调控研究根据前期对绵羊骨骼肌进行高通量测序，发现miR-192(序列见序列表中SEQIDNO：1)在绵羊骨骼肌胎儿期和出生后差异表达，并利用qPCR验证这一结果。接下来是对miR-192的一些基本生物特性进行了分析，包括miR-192在基因组中的位置，miR-192的前体(发夹结构)及在发夹结构中的位置，miR-192在各物种中的保守性。miR-192在绵羊骨骼肌生长发育过程中呈现差异表达，可能对骨骼肌的生长发育有一定的作用。对绵羊骨骼肌卫星细胞经过诱导分化，在分化0、1、3天，收集细胞，RT-qPCR检测miR-192的表达量，发现miR-192下调表达。将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达。转染体系为：在上述体系中，先将miR-192类似物或对照与opti-MEM充分混匀，再将lipofectamine3000与opti-MEM充分混匀；然后将2种混合物混合，孵育5分钟，加入培养基中。37℃，5％CO2培养箱中培养4h。然后更换分化培养基，诱导绵羊骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天。收集细胞，利用细胞免疫荧光检测肌管形成情况，结果如图1所示。免疫荧光所用一抗为小鼠抗肌球蛋白重链(myosinheavychain,MHC)，二抗为AlexaFluor-488标记的兔抗小鼠IgG。为了确定miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的作用，利用刮伤-愈合的方法检测过表达miR-192后的绵羊骨骼肌卫星细胞在细胞增殖迁移上是否受到影响。首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达。更换新鲜生长培养基后，待细胞继续生长48h，用1ml移液枪枪头，在培养皿上刮一下，造成刮后伤痕。更换低浓度血清培养基后继续培养24h，观察愈合本文档来自技高网...

【技术保护点】
绵羊miR‑192序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.绵羊miR-192序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:1所示。
2.在绵羊骨骼肌卫星细胞中，权利要求1所述的miR-192序列在抑制成肌分化中的应
用。
3.在绵羊骨骼肌卫星细胞中，权利要求1所述的miR-192序列在促进增殖中的应用。
4.权利要求1所述的miR-192序列在抑制绵羊骨骼肌卫星细胞RB1基因的蛋白水平表达
中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的miR-192序列在绵羊骨骼肌卫星细
胞内通过结合靶向RB1基因的3’非编码区来抑制RB1基因的表达。
6.权利要求1所述的miR-192序列对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控检测方法，其特
征在于，包括如下步骤：
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵倩君，马月辉，赵谦，关伟军，浦亚斌，康晔，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11