诱导多潜能脂肪干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其培养过程中应用了无柄灵芝素F。所述方法步骤如下：（1）分离培养大鼠ADSCs；（2）成骨诱导分化：取生长状态良好的第3代ADSCs细胞，常规消化、终止消化、离心、重悬细胞，以100个/孔接种于预置有盖玻片的6孔板中，待其完全贴壁后将实验组换为成骨诱导培养基1进行成骨诱导培养1天，第2天换液,换成成骨诱导培养基2，继续成骨诱导7d;本发明专利技术创新地将无柄灵芝素F应用于将诱导多潜能脂肪干细胞诱导快速高效（8d）分化成为成骨细胞，而且由于无柄灵芝素F来源于无柄灵芝，其长期安全性有保障，具有直接应用于体内的潜力。

Methods of inducing pluripotent adipose stem cells

【技术实现步骤摘要】
诱导多潜能脂肪干细胞的方法
本专利技术涉及一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，属于生物工程

技术介绍
成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞,这种细胞能够自我更新并且能够分化形成该组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态,在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。成体干细胞与胚胎干细胞相比,其增殖能力有限。就分化潜能而言,胚胎干细胞具有多能性,可形成体内多种细胞,而成体干细胞只能分化为某些特定组织的细胞类型。成体干细胞普遍存在,问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体,与干细胞相互作用,控制干细胞的更新和分化。成体干细胞中研究的比较多的是骨髓间充质干细胞。然而,传统的取骨髓方法会给患者带来一些痛苦,通常需要全麻或椎管内麻醉,并且数量少,体外扩增耗费时间长,价格昂贵。动物体内有两种脂肪组织,一种是棕色脂肪组织,,一种是白色脂肪组织。主要分布于刚出生的动物肩脚部,而在体内分布分两种,一种为皮下脂肪,另一种为内脏脂肪。目前,国内外学者已分别从这两种脂肪组织中获得了脂肪干细胞。鉴于脂肪干细胞具有易获得性、安全、可迅速扩增及多向分化能力等特点,其将成为具有广阔治疗应用前景的一类成体干细胞。脂肪干细胞具有向脂肪细胞,肌细胞、软骨细胞、骨细胞及神经细胞等分化的能力如,分化的机制尚不清楚。骨科常见疾病如骨折、骨肿瘤、骨结核等均能造成骨质缺损，常须行植骨治疗。骨组织工程技术可用来修复人体缺损的骨组织脂肪干细胞可能作为骨组织工程的种子细胞，提高其成骨分化效率，是亟待解决的问题。本专利技术旨在提供一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，具体为向高效诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化，具有很大的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，具体为向高效诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化，具有很大的应用潜力。无柄灵芝GanodermaresinaceumBoud又名圆孔灵芝、扁灵芝、树芝、三秀灵芝等，作为灵芝属的1个种，与赤芝、紫芝一样，长期被用于预防和治疗各类疾病。杨桥芬等从无柄灵芝中分离出数个化合物，其中无柄灵芝素F是1个新的杂萜。无柄灵芝素F呈黄色固体状，分子式为：C20H28O6。空间相关结构如下所示：本专利技术团队意外发现无柄灵芝素F可以应用于诱导多潜能脂肪干细胞，具体为向高效诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化，在骨组织工程技术上具有很大的应用潜力。本研发团队首次将无柄灵芝素F应用于将诱导多潜能脂肪干细胞诱导分化成为成骨细胞，作为骨组织工程的种子细胞，提高其成骨分化效率，具有非常重要的意义。本专利技术所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其包括：培养过程中应用了无柄灵芝素F。作为优选，其步骤如下：（1）分离培养原代ADSCs进行传代培养；（2）成骨诱导分化：取生长状态良好的第3代ADSCs细胞，消化、终止消化、离心、重悬细胞，以100个/孔接种于预置有盖玻片的6孔板中，待其完全贴壁后将实验组换为成骨诱导培养基1进行成骨诱导培养1天，第2天换液,换成成骨诱导培养基2，继续成骨诱导7d；所述成骨诱导剂培养基1和成骨诱导剂培养基2为含有无柄灵芝素F的培养基。作为进一步优选，所述成骨诱导剂培养基1和成骨诱导剂培养基2为含有无柄灵芝素F的DMEM培养基。作为优选，所述成骨诱导剂培养基1：含有10%FBS、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素Ｃ、20mg/L无柄灵芝素F的DMEM培养基。作为优选，所述成骨诱导剂培养基2：含有10%FBS、50mg/L维生素Ｃ、100mg/L无柄灵芝素F的DMEM培养基。作为优选，分化培养后用茜素红染色法进行鉴定。进一步优选，所述方法步骤如下：（1）分离培养大鼠ADSCs：参考文献（ZukPA，ZhuM，MizunoH，etal．Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies［J］．TissueEng，2001，7:211-28．）的方法：取1只健康3-4周SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后使用75%酒精浸泡15min，于超净工作台中分离大鼠腹股沟皮下脂肪，使用含1%双抗的PBS清洗3次。将脂肪组织剪碎后加入双倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，混合均匀。将密封的离心管置于37℃恒温水浴锅中缓慢震荡消化60min后，1200r/min离心20min，去除上层油脂、未消化的脂肪组织及纤维结缔组织等。磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffersaline，PBS)重悬细胞，200μm滤网过滤后，以1200r/min离心10min，去除上层液面漂浮的油脂，重复上述步骤至去净悬浮油脂。使用含10%胎牛血清(fetalcalfserum，FBS)的LG-DMEM重悬细胞，接种于T25培养瓶中，置于振荡恒温细胞培养箱中37℃恒温培养，以后每3d换液1次。原代培养的细胞融合成片后按1∶3的比例传代培养。（2）成骨诱导分化：取生长状态良好的第3代ADSCs细胞，常规消化、终止消化、离心、重悬细胞，以100个/孔接种于预置有盖玻片的6孔板中，待其完全贴壁后将实验组换为成骨诱导培养基1进行成骨诱导培养1天，第2天换液,换成成骨诱导培养基2，继续成骨诱导7d；成骨诱导剂培养基1：含有10%FBS、0.1μmol/L地塞米松、50mg/L维生素Ｃ、20mg/L无柄灵芝素F的DMEM培养基。成骨诱导剂培养基2：含有10%FBS、50mg/L维生素Ｃ、100mg/L无柄灵芝素F的DMEM培养基。鉴定：茜素红染色后镜下观察，以细胞基质被茜素红染成红色为阳性结果。具体参考现有技术：PBS清洗2遍，体积分数95%乙醇固定10min，PBS清洗2次，每孔加入1mL0.2%茜素红-Tris-HCl避光孵育30min，PBS清洗2遍，于倒置显微镜下摄片观察。一般而言，从脂肪干细胞诱导成茜素红染色阳性的成骨细胞需要经过2-3周时间，但是用本专利技术的方法，可以明显缩短时间到6天，大大缩小了诱导时间，并且提高了细胞活性。骨质疏松性骨折(osteoporosisfracture，OPF)，是骨质疏松症最严重的并发症，已成为当今社会严重危害患者生存质量和占用医疗资源的难治性疾病。骨质疏松症患者骨折后由于成骨细胞成骨能力减弱以及破骨细胞骨吸收能力增强导致治疗周期长、并发症多和死亡率升高。因此如何在治疗原发病的同时促进骨折愈合，缩短治疗周期，减少再次骨折发生率，是当前骨质疏松骨折治疗中的难点与热点。本专利技术的脂肪干细胞诱导方法在骨质疏松骨折治疗将极具潜力。本专利技术的优点：脂肪间充质干细胞(也叫脂肪干细胞)具有较强的增殖能力和多向分化潜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其特征在于：/n诱导分化培养过程中应用了无柄灵芝素F。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其特征在于：
诱导分化培养过程中应用了无柄灵芝素F。


2.权利要求1所述的诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其特征在于：
无柄灵芝素F分子式为：C20H28O6。


3.权利要求1所述的诱导多潜能脂肪干细胞的方法，其特征在于步骤如下：
（1）分离培养原代ADSCs进行传代培养；
（2）成骨诱导分化：
取生长状态良好的第3代ADSCs细胞，消化、终止消化、离心、重悬细胞，以100个/孔接种于预置有盖玻片的6孔板中，待其完全贴壁后将实验组换为成骨诱导培养基1进行成骨诱导培养1天，第2天换液,换成成骨诱导培养基2，继续成骨诱导7d；
所述成骨诱导剂培养基1和成骨诱导剂培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦丹，李晗，吴雷振，秦志华，任翔，潘肖芬，
申请(专利权)人：潘肖芬，河南创新生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44