本发明专利技术涉及用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，可有效解决现有胰岛素抵抗细胞模型建模困难，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低，胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存的问题，其解决的技术方案是，1）细胞培养；2）葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度；3）In‑cell Western；本发明专利技术选用油酸钠对大鼠心肌细胞株进行诱导，并成功建立胰岛素抵抗模型，首次证实油酸钠可以诱导细胞胰岛素抵抗，并明确了其诱发机制，开辟了油酸钠的新用途，是采用油酸钠诱导细胞胰岛素抵抗模型建立方法上的创新。
Establishment of insulin resistance H9c2 cell model induced by sodium oleate
【技术实现步骤摘要】
一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法
本专利技术涉及医药领域，特别是一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法。
技术介绍
胰岛素抵抗是一种由于各种原因导致机体对生理水平的胰岛素敏感性降低的病理状态，可表现为空腹血糖升高，高胰岛素血症，血脂紊乱，高血压等，是Ⅱ型糖尿病的发病基础，也是代谢综合征的核心。由胰岛素抵抗引发的多种代谢性疾病，会增加患者发生心肌损伤的发病率和患病后的死亡率。寻找治疗胰岛素抵抗的活性化合物，并在细胞水平探明这些化合物的作用机制是当代研究人员的义不容辞的责任。目前常用的胰岛素抵抗细胞模型的建立方法包括棕榈酸、葡萄糖、胰岛素诱导法，但各种方法均具有一定的缺陷。棕榈酸具有明显的细胞毒性，这种毒性在200μmol/L的浓度下就开始逐渐显现，而该浓度却是诱导细胞胰岛素抵抗的常用浓度，而且由于棕榈酸是一种脂肪酸，所以它水溶性较差，又加大了建立模型时操作上的困难；由于葡萄糖是细胞生存的必须营养物质，这就决定了一些对营养物质需求较高的细胞例如心肌细胞，骨骼肌细胞等可能具有较高的葡萄糖耐受性，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低；胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存，所以寻找新的胰岛素抵抗建模方法非常必要。诱导胰岛素抵抗发生的因素十分复杂，尚未完全确定，但可以明确的是胰岛素抵抗均伴随游离脂肪酸水平的升高，而过量油酸，棕榈酸等的脂肪酸诱导又会造成胰岛素抵抗。目前，采用油酸钠诱导细胞胰岛素抵抗模型的方法未见报道。
技术实现思路
<br>针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，可有效解决现有胰岛素抵抗细胞模型建模困难，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低，胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存的问题。本专利技术解决的技术方案是，具体包括以下步骤：1)细胞培养H9c2使用添加3.70g/LNaHCO3，3.6g/LHepes，100U/mL青霉素和100g/mL链霉素为配方配制的DMEM(培养基)，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO2(V/V)，饱和湿度的CO2培养箱中培养，待细胞长至70-80％处于对数生长期时进行实验；2)葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度分别设立空白培养基对照孔、正常(NC)组和油酸钠浓度梯度组，H9c2细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中除空白培养基孔以外的实验孔，次日待细胞贴壁后给予空白孔和NC组完全培养基；分别给予油酸钠浓度梯度组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基，每组平行6个复孔，在CO2培养箱中培养24h后检测各孔培养基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培养4h后，检测各个测量孔的OD值，各组葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-测量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；3)In-cellWestern设立NC和SO组，每个蛋白设立三个复孔，以5×104个/mL的密度接种H9c2于避光的96孔板中，给予NC组完全培养基，SO组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基，药物干预24h后，弃去培养基，以3.7％甲醛固定细胞20min，0.1％Triton透化5次/5min，5％脱脂奶粉封闭1.5h，加入以封闭液稀释的待测抗原的特异性抗体，包括GLUT4、p-IRS-1、IRS-1、β-tubulin，在4℃孵育18h后，以含有0.02％Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤除去未结合抗体，以相应荧光二抗避光孵育1h后，再次洗涤除去未结合二抗，在Odyssey双色红外荧光成像系统下扫描成像并量化数据。本专利技术选用油酸钠对大鼠心肌细胞株(H9c2)进行诱导，并成功建立胰岛素抵抗模型，首次证实油酸钠可以诱导细胞胰岛素抵抗，并明确了其诱发机制，开辟了油酸钠的新用途，是采用油酸钠诱导细胞胰岛素抵抗模型建立方法上的创新。附图说明图1为本专利技术油酸钠对H9c2细胞GLUT4蛋白和IRSS307位点磷酸化水平的影响；注：以In-cellWrstern法检测H9c2细胞GLUT4蛋白和IRSS307位点磷酸化水平。图中所示颜色为复合色，红色表示标注的目的蛋白，绿色表示β-tubulin，每个目蛋白重复三个复孔。NC组的均值设为1，SO组的均值表示为相对于NC组的倍数，数值表示为*P<0.05，**P<0.01与NC组相比。具体实施方式以下结合具体情况对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。本专利技术在具体实施时，包括以下步骤：1)细胞培养H9c2使用添加3.70g/LNaHCO3，3.6g/LHepes，100U/mL青霉素和100g/mL链霉素为配方配制的DMEM(培养基)，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养，待细胞长至70-80％处于对数生长期时进行实验；2)葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度分别设立空白培养基对照孔、正常(NC)组和油酸钠浓度梯度组，油酸钠浓度梯度组包括SO-50、100、150、200、250组，H9c2细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中除空白培养基孔以外的实验孔，次日待细胞贴壁后给予空白孔和NC组完全培养基；分别给予SO-50、100、150、200、250组含50、100、150、200、250μmol/L油酸钠的完全培养基，每组平行6个复孔，在CO2培养箱中培养24h后检测各孔培养基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培养4h后，检测各个测量孔的OD值，各组葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-测量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；3)In-cellWestern(定量整个细胞内信号的方法)设立NC和SO组(油酸钠浓度梯度组)，每个蛋白设立三个复孔，以5×104个/mL的密度接种H9c2于避光的96孔板中，给予NC组完全培养基，SO组含150μmol/L油酸钠的完全培养基，药物干预24h后，弃去培养基，以3.7％甲醛固定细胞20min，0.1％Triton透化5次/5min，5％脱脂奶粉封闭1.5h，加入以封闭液稀释的待测抗原的特异性抗体，包括GLUT4、p-IRS-1、IRS-1、β-tubulin，在4℃孵育18h后，以含有0.02％Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤除去未结合抗体，以相应荧光二抗避光孵育1h后，再次洗涤除去未结合二抗，在Odyssey双色红外荧光成像系统下扫描成像并量化数据。本专利技术经试验证实油酸钠可以通过激活IRS-1S307位点的磷酸化，抑制GLUT4蛋白表达，诱导H9c2细胞的胰岛素信号分子功能障碍，最终降低葡萄糖消耗率，引发胰岛素抵抗。并明确其诱发机制，有关实验资料如下：1实验材料1.1实验细胞H9c2购自中科院上海细胞库。1.2试剂与仪器油酸钠(SO；C10078860，Macklin，China)；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)细胞培养/nH9c2使用添加3.70g/L NaHCO
【技术特征摘要】
1.一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞培养
H9c2使用添加3.70g/LNaHCO3，3.6g/LHepes，100U/mL青霉素和100g/mL链霉素为配方配制的DMEM，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养，待细胞长至70-80％处于对数生长期时进行实验；
2)葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度
分别设立空白培养基对照孔、正常组和油酸钠浓度梯度组，H9c2细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中除空白培养基孔以外的实验孔，次日待细胞贴壁后给予空白孔和NC组完全培养基；分别给予油酸钠浓度梯度组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基，每组平行6个复孔，在CO2培养箱中培养24h后检测各孔培养基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培养4h后，检测各个测量孔的OD值，各组葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-测量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；
3)In-cellWestern...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓珂，张奇，袁培培，傅阳，侯颖，高丽媛，魏亚新，冯卫生，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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