【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体公开了来源于扁蓿豆的u6启动子及其应用。
技术介绍
1、基因编辑是对生物基因组进行靶向修饰的一项新型生物技术，可以在不同物种中实现对目标基因的定点敲除、定点插入以及基因片段置换等基因定向编辑。目前基因编辑技术已在植物基因功能解析和作物遗传改良研究中得到广泛应用。常用的基因编辑技术主要有锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,zfns)，talen核酸酶(transcriptionactivator like effector nucleases,talens)，crispr/cas(规律成簇间隔短回文重复序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associatedprotein)等。1996年，kim等首先报道了将锌指蛋白连接到fokⅰ的dna切割结构域可以产生1个新型的有活性的位点识别特异性锌指核酸酶，并且该人工改造的新型锌指核酸酶可以特异性地切割dna序列，标志着zfn基因编辑技术的出现。2009年后，zfns技术的不断发展，已成功在烟草、玉米、拟南芥、大豆等植物中实现了基因的定点修饰，然而zfns载体的构建的过程较为繁琐，耗时耗力，还会对基因组产生非特异性识别和切割，这些不利因素都制约了它在基因编辑上的广泛应用。随后出现的第二代人工改造核酸酶技术talen构成与zfn相似，由tal效应因子(transcription activator-like effector)的dna结合域与核酸酶fo
2、作为crispr/cas9基因编辑体系中的重要元件，cas9蛋白和sgrna的精确和高效转录影响着该体系的特异性和编辑效率，二者的高效精确转录依赖于合适的启动子。cas9蛋白常用组成型启动子驱动其转录，主要有camv 35s启动子、camv 2×35s启动子和ubi启动子，少数研究者还使用actin1启动子来驱动cas9蛋白的转录。sgrna的序列上存在与靶点互补配对的序列，它的精确转录对提高crispr/cas9基因编辑体系的编辑效率和降低脱靶效率具有重要的作用。使用u3动子驱动sgrna的转录常用于单子叶植物，而使用u6启动子驱动sgrna的转录则常用于双子叶植物中，也有部分研究者使用camv 35s启动子来驱动sgrna的转录。无论使用上述何种启动子驱动cas9蛋白和sgrna的转录，均有成功靶向基因的研究，但是不同的启动子在驱动sgrna转录时，编辑的效率通常也不同。
3、u6启动子驱动转录的u6snrna是一种非编码小rna，序列保守约为100nt，被rna聚合酶ⅲ所识别和转录，可以用来产生大量的人工rna，参与mrna前体的变异剪切和成熟。u6启动子具有高效的转录性和明确的转录起始位点g，可以精确转录sgrna，减少sgrna表达时对其他序列转录的影响，增强sgrna中与靶位点序列配对的准确性，从而减少脱靶效应的产生。因此，u6启动子成为双子叶植物的crispr/cas9系统中常用的理想启动子。而具备转录活性的u6启动子，需同时具有2个保守的核心区序列元件，即-30bp位点处的tata-like box和-60bp处的上游序列元件(upsteam sequence element,use)。其中tata box是rna聚合酶ⅲ识别和结合以及驱动转录的关键元件，而use作为另一个核心区元件常调控u6启动子的转录活性。雷建峰等利用crispr/cas9基因组编辑技术体系构建了以拟南芥atu6启动子驱动抗旱负调控基因ggb编辑sgrna的基因编辑表达载体，并将构建的载体通过农杆菌介导法转化到野生型拟南芥，获得了ggb基因敲除突变体，t1代的突变效率高达84.8％。hyun等构建了由拟南芥atu6启动子驱动sgrna转录，靶向修饰拟南芥ft基因和spbplike-4基因的cas9/sgrna编辑载体，并在转基因后代中检测到靶位点存在突变，在t1植物的分析组织中，约90％的独立染色体dna片段携带突变。thomas等克隆了大豆gmu6启动子，成功构建了靶向敲除绿色荧光蛋白基因gfp的crispr/cas9基因编辑载体，结果检测到了95％的靶向dna突变。jiang等在水稻中用克隆的水稻osu6启动子驱动sgrna的转录构建了表达载体，并成功转入水稻原生质体中，定点编辑了ossweet14和ossweet11两个基因。u6启动子通常具有物种特异性，亲缘关系较远的物种之间并不通用，植物自身内源u6启动子具有更高的转录活性。如在棉花中，使用棉花gbu6启动子的crispr/cas9体系的编辑效率比使用拟南芥atu6启动子时高4-6倍。在大豆中，使用大豆gmu6启动子的基因编辑载体的突变率比使用拟南芥atu6启动子的载体高10％。除了在拟南芥、水稻、大豆、棉花上的应用，目前还在小麦、玉米、番茄等多种植物中利用植物自身的u6启动子建立crispr/cas9基因组编辑系统，实现目的基因的高效编辑。
4、扁蓿豆，又名花苜蓿，为豆科苜蓿属多年生草本植物，其多分布于我国西北、内蒙古、华北寒旱地区。扁蓿豆多分枝，叶量丰富，富含蛋白质，多种维生素和矿物质，营养价值较高，是一种优质牧草。虽然相比较紫花苜蓿，其植株矮小，产量偏低，但是其具有较强的抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.扁蓿豆U6启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1至1020bp所示、SEQ ID NO.3的第1至1044bp所示、SEQ ID NO.4的第1至1032bp所示、SEQ ID NO.5的第1至1036bp所示的任意之一；
2.如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子在目的基因的表达中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其是在扁蓿豆基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
5.一种基因表达的载体，其特征在于：含有如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，其是一种基因编辑载体。
7.权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体的出发载体是pGreenⅡ-0800。
8.一种表达盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的扁蓿豆U6启动子及与其可操作连接的目的基因。
9.权利要求5或6或7所述的载体或如权利要求8所述的表达盒在扁蓿豆基因编辑中的应用
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：应用于扁蓿豆CRISPR/Cas9编辑系统，用于驱动sgRNA的表达。
...【技术特征摘要】
1.扁蓿豆u6启动子，其核苷酸序列如seq id no.1的第1至1020bp所示、seq id no.3的第1至1044bp所示、seq id no.4的第1至1032bp所示、seq id no.5的第1至1036bp所示的任意之一；
2.如权利要求1所述的扁蓿豆u6启动子在目的基因的表达中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其是在扁蓿豆基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用于扁蓿豆crispr/cas9编辑系统，用于驱动sgrna的表达。
5.一种基因表达的载体...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。