一种磺酰基转移酶、应用及其介导的氮丙啶环生物合成方法技术

本发明专利技术涉及一种磺酰基转移酶、应用及其介导的氮丙啶环生物合成方法，步骤为：将底物、3'‑磷酸腺苷‑5'‑磷酸硫酸及磺酰基转移酶用PBS缓冲液稀释到相应的浓度：在25‑42℃下反应20min‑2h，然后加入0.5mol/L的NaOH调节使体系pH为10.0以上，生成氮丙啶环化合物。本发明专利技术首次利用磺酰基转移酶生物催化合成了氮丙啶三元环，确定了酶催化合成氮丙啶环的基本反应条件，并建立了一套氮丙啶环的体外催化合成体系，为进一步通过组合生物合成的方式获得更多的具有良好成药前景的氮丙啶类结构衍生物奠定理论基础。同时也为实现氮丙啶类药物中间体的绿色合成与制造提供理论依据。

A sulfonyltransferase, its application and its mediated biosynthesis of aziridine ring

【技术实现步骤摘要】
一种磺酰基转移酶、应用及其介导的氮丙啶环生物合成方法
本专利技术属于酶催化生物合成
，涉及氮丙啶三元环的生物合成方法，尤其是一种磺酰基转移酶、应用及其介导的氮丙啶环生物合成方法。
技术介绍
氮丙啶环(Aziridine)是由一个氮原子和两个碳原子组成的三元环状结构；其结构为：由于三元环结构紧凑，环张力很大，因此具有很强的化学反应活性，可与多种化学基团(包括：各种亲核基团、有机锂试剂和吉尔曼试剂等)发生开环反应、取代反应和加成反应等，在药物中间体合成以及其它有机合成过程中具有重要的用途。同时，Aziridine也是很多天然活性产物的重要官能基团，可介导氮丙啶类天然产物与生物大分子(蛋白质、核酸)之间的相互作用，并导致生物大分子发生结构和功能的改变。目前临床上比较重要的几种抗肿瘤药物，如丝裂霉素C(MitomycinC)、甲基丝裂霉素(Porfiromycin)以及噬癌菌素A(CarzinophilinA)等均含有氮丙啶官能团结构。另外，还有很多人工合成或半合成的氮丙啶结构衍生物，如：12ɑ,13ɑ-aziridinylepothilone、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磺酰基转移酶，其特征在于：其构建步骤如下：/n⑴重组表达载体pET28a(+)-fic28的构建：/n以非昔罗霉素磺酰基转移酶基因fic28为目的基因，该基因fic28的基因序列为SEQNO.1，以S.ficellusNRRL8067工程菌株基因组为模板，质粒pET28a(+)为表达载体，设计引物，引物序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3，所用酶切位点为NcoI、XhoI，进行PCR扩增；/n每50μL目的基因PCR扩增体系及条件如下所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种磺酰基转移酶，其特征在于：其构建步骤如下：
⑴重组表达载体pET28a(+)-fic28的构建：
以非昔罗霉素磺酰基转移酶基因fic28为目的基因，该基因fic28的基因序列为SEQNO.1，以S.ficellusNRRL8067工程菌株基因组为模板，质粒pET28a(+)为表达载体，设计引物，引物序列为SEQNO.2、SEQNO.3，所用酶切位点为NcoI、XhoI，进行PCR扩增；
每50μL目的基因PCR扩增体系及条件如下所示：



PCR反应条件：



得到的目的DNA-fic28先与T-VectorpMD19(Simple)质粒载体连接，切胶回收得到带有酶切位点的目的基因，再与带有相应酶切位点的pET28a(+)载体连接并转化到大肠杆菌JM109中，提取质粒双酶切验证，通过核酸电泳检测；验证正确的质粒测序，将测序正确的重组载体转化到E.coliRosseta(DE3)表达菌株中，保存菌株以便后续使用；
⑵磺酰基转移酶在E.coliRosseta(DE3)中的表达纯化及检测：
将携带pET28a(+)-fic28质粒的E.coliRosseta(DE3)接于LB液体培养基中37℃复苏培养12-16h，再转接到LB液体培养基中37℃扩大培养至OD值＝0.8±0.1，加入诱导剂IPTG进行诱导，诱导剂IPTG的终浓度为0.3-0.7mM，16℃下诱导20-24h，由于表达的磺酰基转移酶为胞内酶，故离心取菌体，经超声破碎后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测；将异源表达的磺酰基转移酶进行纯化、浓缩，经过SDS-PAGE凝胶电泳进行检测验证，验证正确即得磺酰基转移酶。


2.根据权利要求1所述的磺酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会图，岳荣，李萌，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12