一种果糖基转移酶的基因序列及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种果糖基转移酶的基因序列及其制备方法和应用，属于食品生物技术领域。本发明专利技术以米曲霉Aspergillus oryzae ZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因 1872 bp 片段，并且确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列。本发明专利技术设计了一对用于通过 PCR 方法扩增果糖转移酶基因片段的引物，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了米曲霉果糖基转移酶基因的编码序列，该序列被验证为全新的基因序列。

Gene sequence of a fructosyltransferase and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种果糖基转移酶的基因序列及其制备方法和应用
本专利技术涉及食品生物
，具体是一种果糖基转移酶的基因序列及其制备方法和应用。
技术介绍
低聚果糖又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-1-2糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体：蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较少(<1％)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶(果糖基转移酶)可得到高纯度、高产量的低聚果糖，果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖催化获得蔗果三糖等低聚糖。在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。王立梅等对一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性进行研究，在pH5.5，30℃条件下，果糖基转移酶具有最高活性。郑氏金云等研究了在不同蔗糖浓度下从黑曲霉AS0023纯化的转化酶(INV)和果糖转移酶(FTS)的酶催化活力。在将来的研究过程中，具有优良催化性能的优良果糖基转移酶基因的挖掘与发现显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种果糖基转移酶的基因序列及其制备方法和应用，本专利技术以米曲霉AspergillusoryzaeZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因片段，并且确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列。本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种果糖基转移酶，其核苷酸序列为SEQIDNO：1；其氨基酸序列为SEQIDNO：2。所述的果糖基转移酶，其制备方法为：以米曲霉AspergillusoryzaeZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因1872bp片段。所述的引物包括正向引物和反向引物，正向引物P1：5′-ATGAGGCTCTCAACCGC-3′；反向引物P2：5'-TTAGCCAATGCCTTGT-3'。所述的基因扩增为PCR扩增，PCR条件如下：在95℃初始变性5分钟，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，得到PCR产物；将PCR产物与pMD18-TVector于16℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞,用含氨苄的选择性LB平板37℃培养,挑选白斑,接种含氨苄的LB液体培养基,37℃震荡培养过夜,提取质粒用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,阳性菌液送上海生工测序。所述的米曲霉AspergillusoryzaeZT65保藏编号为CCTCCNO:M2014422，保藏日期为2014年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。该米曲霉AspergillusoryzaeZT65可应用于果糖基转移酶制剂生产中。本专利技术获得的果糖基转移酶的核苷酸序列，可以进一步用于果糖转移酶基因的克隆表达，也可以用于重组表达得到果糖转移酶后应用于功能性低聚果糖的生物制备。本专利技术的有益效果：1、本专利技术以米曲霉AspergillusoryzaeZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因1872bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列。本专利技术设计了一对用于通过PCR方法扩增果糖转移酶基因片段的引物，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了米曲霉果糖基转移酶基因的编码序列，该序列被验证为全新的基因序列。2、本专利技术的果糖基转移酶具有较宽的pH稳定范围，经测定，其在pH4.0～11.0条件下稳定。3、本专利技术的果糖基转移酶具有高催化效率：经测定，Km、kcat分别为307mmolL-1和1.962×103min-1。4、本专利技术的果糖基转移酶具有高低聚果糖转化率，经测定，转化物浓度为63.9％(w/w)。序列说明SEQIDNO：1果糖基转移酶基因组DNA序列，其由1872个碱基组成；SEQIDNO：2果糖基转移酶推导的氨基酸序列，由593个氨基酸残基组成。附图说明图1为本专利技术的果糖基转移酶PCR扩增结果；图2为本专利技术的果糖基转移酶pH稳定范围的检测结果；图3为本专利技术的果糖基转移酶催化效率的检测结果；图4为本专利技术的果糖基转移酶的高低聚果糖转化率的检测结果。具体实施方式为了使本专利技术的技术方案和优点更加清楚，下面结合本专利技术的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1果糖基转移酶的制备方法为：以米曲霉AspergillusoryzaeZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因1872bp片段。所述的引物包括正向引物和反向引物，正向引物P1：5′-ATGAGGCTCTCAACCGC-3′；反向引物P2：5'-TTAGCCAATGCCTTGT-3'。所述的基因扩增为PCR扩增，PCR条件如下：在95℃初始变性5分钟，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，得到PCR产物(结果如图1所示)；将PCR产物与pMD18-TVector于16℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞,用含氨苄的选择性LB平板37℃培养,挑选白斑,接种含氨苄的LB液体培养基,37℃震荡培养过夜,提取质粒用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,阳性菌液送上海生工测序。实施例2果糖基转移酶最适pH及pH稳定性测定：将从米曲霉AspergillusoryzaeZT65发酵液里分离纯化得到的果糖基转移酶在不同的pH条件下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.2mol/L的磷酸缓冲液中55℃中进行果糖基转移酶酶活力测定。结果表明，果糖基转移酶的最适pH为6时酶活力最高。果糖基转移酶于上述各种不同pH的缓冲液中25℃处理24h，以研究酶的pH稳定性。结果表明，果糖基转移酶在pH4.0～11.0之间具有较高稳定性，处理24h后，酶活力残留80％以上(检测结果如图2所示)。这说明，该果糖基转移酶具有较宽的pH稳定范围。实施例3果糖基转移酶动力学参数测定：用不同浓度的蔗糖为底物，在0.1M磷酸盐pH5.5缓冲液体系中，55℃条件下测定酶活性，计算出其在55℃条件下的动力学参数(如图3所示)。经测定，以蔗糖为底物时，Km、kcat分别为307mmolL-1和1.962×103min-1。实施例4果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖：采用上述果糖基转移酶催化底物蔗糖(500g/L)，55℃、PH6.0条件催化处理12h，采用HPLC测定反应体系中低聚果糖的浓度。通过测定分析计算，确定低聚果糖的含量可达63.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果糖基转移酶，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种果糖基转移酶，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：1。


2.根据权利要求1所述的果糖基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO：2。


3.根据权利要求1或2所述的果糖基转移酶，其特征在于：其制备方法为：以米曲霉AspergillusoryzaeZT65的基因组为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了果糖转移酶的编码基因1872bp片段。


4.根据权利要求3所述的果糖基转移酶，其特征在于：所述的引物包括正向引物和反向引物，正向引物P1：5′-ATGAGGCTCTCAACCGC-3′；反向引物P2：5'-TTAGCCAATGCCTTGT-3'。


5.根据权利要求3所述的果糖基转移酶，其特征在于：所述的基因扩增为PCR扩增，PCR条件如下：在95℃初始变性5分钟，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁智群，陈桂光，韩苏苏，曾伟，叶童，冷硕，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45