一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法技术

一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖‑6‑磷酸的方法，属于酶工程领域，本发明专利技术包括克隆耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，亲和层析纯化获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；将浓度为0.01‑10μg/ml的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、浓度为0.1‑20mM的果糖‑6‑磷酸和浓度为0.1‑20mM的二磷酸尿苷葡糖在70℃下反应1‑24h获得蔗糖‑6‑磷酸。该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶最适反应温度为70℃，可耐受温度达100℃，能够在100℃保持酶活性，并催化蔗糖‑6‑磷酸的生成，适用于工业生产蔗糖‑6‑磷酸。

A method for the synthesis of sucrose-6-phosphate by recombinant high temperature resistant sucrose phosphate synthetase

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法。
技术介绍
蔗糖磷酸合成酶(EC2.4.1.14)(Sucrose-phosphatesynthase，SPS)属于GT-B型糖苷转移酶。SPS存在于植物、蓝藻等生命体中。SPS是植物和蓝藻合成蔗糖的一个关键酶，也是合成蔗糖的限速酶。植物和蓝藻可进一步应用磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)水解蔗糖-6-磷酸上的磷酸根而生成蔗糖。目前，由于蔗糖-6-磷酸的制备和纯化具有一定难度，因此在世界范围内，蔗糖-6-磷酸还没有被商业化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，以使蔗糖-6-磷酸商业化。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，包括以下步骤：步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。作为优选的实施方式，步骤一的具体操作步骤如下：摇3-5ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴15-60min；42℃，热激1-2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1-2小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。作为优选的实施方式，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是从细长嗜热聚球藻BP-1中克隆或基因合成得到。作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：(1)挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10mlLB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，过夜培养；扩大到1LLB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-220rpm，培养至指数生长期；加入0.1-10mMIPTG诱导蛋白质表达，诱导温度37℃，诱导时间为2-24h；第二天4000-6000g离心收集细菌；(2)弃上清，加入50ml细菌裂解液，充分悬浮细菌，超声裂解细菌5-30min，功率30％，开3秒，关3秒；(3)12000-16000g离心15-60min去沉淀，收集上清，上清中含有带His标签的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；(4)将上清与Ni-NTA结合，结合温度为4℃，结合时间为0.5-2h；(5)washbuffer洗脱杂蛋白，elutionbuffer洗脱目的蛋白；(6)按照每管收集1ml蛋白质洗脱液的量收集，采用考马斯亮蓝染液检测目的蛋白；(7)按照5-10U凝血酶切1mg蛋白的量切His标签，并进行透析，透析液为10mM、pH7.5的Tris-HCl和150mM的NaCl，操作温度为4℃。作为优选的实施方式，步骤(2)中，所述细菌裂解液中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述washbuffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和20mM的咪唑。作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述elutionbuffer中含有：50mM、pH8.0的Tris-HCl，150mM的NaCl和500mM的咪唑。作为优选的实施方式，步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为2μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为10mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为10mM。本专利技术还提供一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法合成的蔗糖-6-磷酸。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖合成了蔗糖-6-磷酸。通过对耐高温蔗糖磷酸合成酶进行了原核表达、分离纯化以及酶学性质的鉴定，发现该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶具有耐高温的特性，耐受温度可达100℃，适用于工业生产蔗糖-6-磷酸并使蔗糖-6-磷酸商业化。本专利技术中的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶能够在100℃保持酶活性，并催化蔗糖-6-磷酸的生成，适用于工业生产蔗糖-6-磷酸。附图说明图1为本专利技术的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法的流程图。图2为重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的SDS-PAGE分析结果。图中，M、非预染的蛋白质Marker；1、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的条带；2、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的washbuffer流出；3、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的蛋白流出；4、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的蛋白上清；5、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的菌体沉淀；6、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶诱导后；7、重组耐高温的蔗糖磷酸合成酶诱导前。图3为实施例5中重组耐高温蔗糖磷酸合成酶反应体系的薄层层析(TLC)结果。图中，1、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸；2、蔗糖；3、果糖-6-磷酸。图4为实施例6中重组耐高温蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应体系的薄层层析(TLC)结果。图中，1、蔗糖；2、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)反应生成的蔗糖；3、重组耐高温蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖生成的蔗糖-6-磷酸。图5为温度、pH和反应时间对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响。图5a为温度对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响；图5b为pH对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响；图5c为反应时间对重组耐高温蔗糖磷酸合成酶活性稳定性的影响。图6为实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；/n步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；/n步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；/n步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；
步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；
步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；
步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。


2.根据权利要求1所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤一的具体操作步骤如下：
摇3-5ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴15-60min；42℃，热激1-2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1-2小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。


3.根据权利要求2所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤二的具体操作步骤如下：
将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。


4.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是从细长嗜热聚球藻BP-1中克隆或基因合成得到。


5.根据权利要求3所述的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，其特征在于，步骤三的具体操作步骤如下：
(1)挑取若干大肠杆菌菌落，并置于5-10mlLB液体培养基中，置于摇床中培养，摇床温度为37℃，摇床转速为180-...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏纪勇，李昱颖，姚圆，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22