【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境生物检测，尤其涉及一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法。
技术介绍
1、铜(cu)作为一种常见的金属离子，广泛存在于自然界和人类活动中，因其良好的导电性能而广泛应用于电力和电子等工业领域，而且也是人体必需微量元素，对人体有益。尽管铜在很多方面对人类和环境有益，但是过量的铜离子排放会带来严重危害。首先长期暴露于高浓度的铜离子环境中会导致各种健康问题，例如饮用水中超标的铜含量引起肠胃不适，恶心呕吐等症状，严重情况下会对肝、胆、肾等器官造成损伤，同时对眼和皮肤也有刺激性。其次若用含铜废水灌溉农田，会使铜在土壤和农作物中累积，从而造成农作物尤其是水稻和大麦生长不良，污染粮食籽粒。而且铜对水生生物的毒性很大，曾在海岸和港湾发生过铜污染引起的牡蛎肉变绿事件。因此，开发能够灵敏，快速检测铜离子污染的检测方法很有必要。传统的电化学法和光谱法等手段检测灵敏度高，检测限低，但需要使用昂贵的仪器以及复杂的样品前处理过程，并由需专业检测人员进行操作，很难实现实时、低成本、现场检测，而且在检测过程中也有造成二次污染。而全细胞生物传感器作为多学科交叉融合的产物，能在一定程度上克服电化学法和光谱法等的局限性，且操作简单，易懂，检测成本低。目前已有许多研究利用基因线路设计构建全细胞生物传感器用于重金属离子的检测。
2、目前铜的全细胞微生物传感器主要有两类，一类是基于转录调节因子cuer调控的单组分系统。在大肠杆菌中，调节蛋白cuer可以与铜结合开启启动子pcopa的转录，从而导致铜的外排蛋白copa表达上调，将细胞质
3、单组份系统通常只能感知细胞内的信号输入，而双组分系统可以感知细胞外，膜内或细胞内的信号输入，所以双组分系统可以响应的输入信号更为广泛，同时也有着很高的特异性，使其在合成生物学中具有不可替代的优势。此外，在双组分系统中参与信号转导的磷酸化和去磷酸化过程促进了响应信号的大幅增强。因此，采用基于cusrs系统的生物传感器成为解决弱信号响应的潜在方案。虽然基于cusrs系统的生物传感器以前已经报道过，但它们的灵敏度不够高且检测限并不低。尤其在实际的检测过程中，来自被测样品的其他信号干扰和仪器检测能力的限制等因素会引入显著的误差，因此信号变化的低倍数阻碍了评估信号真实性的能力，所以提高感应系数(信号放大倍数)的挑战对生物传感器的实际应用构成了重大障碍。这些情况为进一步设计具有更高灵敏度和选择性的重金属离子全细胞生物传感器提供了改进思路。
4、微生物传感器的应用价值主要体现在现场和在线快速检测和预警方面，比如对待测水源是否符合世界卫生组织或国家标准进行检测。世界卫生组织规定饮用水中铜的含量不能超过2.0mg/l(～30μm)，而我国也明确规定了饮用水中铜的含量不能超过1.0mg/l(～15μm)，因此在低铜离子浓度(≤10μm)下，较强的信号响应是这类传感器能否满足实际应用和实现快速转化的试金石。然而，报道的铜的微生物传感器对低浓度铜的信号响应较差，目前性能最好的是基于cuer的微生物传感器，其在1μm时只有2倍的信号增强，即使在10μm下也只有15倍的信号增强。天然cusrs系统同样不能显著提高响应系数(i/i0)，甚至比基于cuer响应系统的传感器还要差，这意味着很难获得具有较高响应系数(i/i0)的微生物传感器来实际检测分析物。
5、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6、采用基于cusrs系统的生物传感器成为解决弱信号响应的潜在方案。虽然基于cusrs系统的生物传感器以前已经报道过，但它们的灵敏度不够高且检测限并不低。尤其在实际的检测过程中，来自被测样品的其他信号干扰和仪器检测能力的限制等因素会引入显著的误差，因此信号变化的低倍数阻碍了评估信号真实性的能力，所以提高感应系数(信号放大倍数)的挑战对生物传感器的实际应用构成了重大障碍。
7、现有铜的微生物传感器的检测灵敏度较差，尤其对低浓度铜的响应很差，不能满足微生物传感器对重金属铜快速检测和预警的要求。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法。
2、本专利技术是这样实现的，利用大肠杆菌中铜的cusrs双组分调控系统构建了一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器。首次阐明了双组分系统中两个重要组分cusr和cuss对传感器性能的影响，同时通过优化两者在细胞内的水平获得高灵敏度、低检测限的传感器，为双组分传感器的构建提供了理论基础；还通过使用可诱导的质粒拷贝数放大系统实现了信号放大，大大提高了输出信号的强度，进一步提高了检测器性能；在此基础上，通过双敲除铜的抗性基因cuscfba和cueo来进一步降低了传感器的检测限；与此同时，本专利技术首次将repl介导的可调节质粒拷贝数的信号放大器模块引入基于cusrs双组分系统的铜传感器中，使其性能得到进一步提升；此外，还首次优化了传感器使用中细胞培养和检测的步骤，新的检测程序可以大幅度提高传感器的响应灵敏度，并大大缩短了检测的实施时间。最终，本专利技术的高效铜传感器在优化的检测程序下，在1μm的铜离子低浓度下即可实现高达100倍的信号增强，且对其它重金属无明显响应，表现出超高的选择性，在现场快速检测、在线监测及水质毒性预警等领域具有极大的应用价值。
3、一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法包括以下步骤：
4、(1)通过聚合酶链式反应分别扩增编码信号放大模块的repl基因和编码报告基因的sfgfp绿色荧光蛋白基因，从igem数据库中获得的核糖体结合位点序列，利用t4 dna连接酶将酶切好的基因元件与质粒pxw109hg按照pmert-rbs1-repl-rbs2-sfgfp的电路顺序进行连接，构建重组质粒pxyhg1；
5、(2)通过聚合酶链式反应分别扩增编码正反馈模块的双向启动子pcusr-pcusc和cusr基因，利用t4 dna连接酶将酶切好的基因元件与重组质粒pxyhg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PmerT核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，rbs1核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，repL核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，rbs2核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，sfGFP绿色荧光蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PcusR-PcusC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，cusR核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
4.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中的cusS核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)中的KanR核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述步
6.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中重组质粒pXYHg1基因线路拆分出rbs1-repL-rbs2-sfGFP片段，所述步骤(2)中传感器基因线路拆分cusR-PcusR-PcusC、repL-rbs2-sfGFP，将扩增的基因进行连接，得到拆分片段后进行拼装，所述步骤(3)中传感器基因线路拆分出cusR-PcusR-PcusC-repL-rbs2-sfGFP片段。
7.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中重组和目的筛选质粒为含有传感器基因线路的重组质粒pCWCu18。
8.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的使用，其特征在于，所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的使用方法步骤如下：
9.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述用于菌株培养的LB培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L，去离子水定容，121℃灭菌20分钟。
...【技术特征摘要】
1.一种用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中的pmert核苷酸序列如seq id no.1所示，rbs1核苷酸序列如seq idno.2所示，repl核苷酸序列如seq id no.3所示，rbs2核苷酸序列如seq id no.4所示，sfgfp绿色荧光蛋白核苷酸序列如seq id no.5所示。
3.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)中的pcusr-pcusc核苷酸序列如seq id no.6所示，cusr核苷酸序列如seqid no.7所示。
4.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中的cuss核苷酸序列如seq id no.8所示。
5.如权利要求1所述用于重金属铜检测的高灵敏微生物传感器的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)中的kanr核苷酸序列如seq id no.9所示，所述步骤(4)中的specr核苷酸序...
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