包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用制造技术

本发明专利技术公开了包载过氧化氢酶且连接PD‑L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用。所述脂质体是一种以大豆磷脂，胆固醇为骨架的包载了过氧化氢酶并且表面连接有aPDL1的多功能免疫脂质体。所述脂质体通过薄膜分散/后插入法制备；所述过氧化氢酶包载在脂质体当中；所述aPDL1是通过反应合成aPDL1导向化合物，插入脂质体磷脂双分子层中；所述脂质体表面还连接有腙键。所述脂质体为球形结构，粒径为118.2±1.763nm，多分散系数为0.223±0.007；过氧化氢酶的包封效率为30‑36％。本发明专利技术所得药物可以有效缓解肿瘤区域低氧同时阻断肿瘤抑制性信号通路(PD‑1/PD‑L1)，对黑色素瘤有较好的治疗作用，在肿瘤免疫治疗方面具有广阔的研究前景。

Application of liposomes containing catalase and PD-L1 antibody in the preparation of tumor drugs

【技术实现步骤摘要】
包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用
本专利技术涉及一种脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用，属于免疫脂质体药物递送系统领域，特别涉及包载过氧化氢酶同时表面连接PD-L1抗体的免疫脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用。
技术介绍
肿瘤细胞可以通过多种机制抑制免疫系统的功能从而逃避免疫系统的识别和杀伤。阻断肿瘤对免疫系统的抑制通常有两种途径，即阻断肿瘤抑制性的信号通路和改善肿瘤抑制性的微环境。免疫检查点蛋白介导的免疫抑制通路通过抑制T淋巴细胞的作用来抑制免疫系统对肿瘤细胞的识别就是一种代表性的免疫抑制机制。由于炎症和抗原的刺激，肿瘤细胞表面过表达抑制性受体，有助于免疫检查点抑制剂靶向结合。相较于其他固体肿瘤而言，黑色素瘤有大量炎性细胞浸润，往往会表达更高水平的抑制性受体。与抑制性受体特异性结合的单克隆抗体(免疫检查点抑制剂)，例如死亡受体1配体抗体(aPDL1s)可以有效抑制黑色素瘤的生长。过去5年中，FDA批准了一些aPDL1生物制剂(例如帕博利珠单抗和尼鲁单抗)来治疗黑色素瘤。研究表明，这些aPDL1生物制剂可以有效抑制黑色素瘤生长，延长患者生存期。然而随着研究深入，发现这些免疫检查点抑制剂会造成自身免疫疾病以及炎性副作用等。这些副作用主要与aPDL1体内分布靶向性较低有关。因此，改善aPDL1体内分布的靶向性，促进其在肿瘤部位浓集，将有望提高其有效性降低毒副作用。改善肿瘤低氧微环境可以促进T淋巴细胞对于肿瘤组织的浸润，增强aPDL1的作用，抑制肿瘤生长。肿瘤组织具有抑制性的微环境，可以抑制T淋巴细胞激活同时促进浸润的T淋巴细胞凋亡，这也是肿瘤的自我保护机制。低氧是肿瘤抑制性微环境的重要组成部分。低氧微环境通过产生调节性的环状单磷酸腺苷(cAMP)并抑制T细胞受体信号通路，抑制T淋巴细胞的激活与浸润，影响aPDL1的作用效果。过氧化氢酶(CAT)可以有效分解肿瘤内源性过量的过氧化氢产生氧气，改善肿瘤低氧微环境，从而有望增强aPDL1的作用效果。因此，aPDL1与过氧化氢酶联合给药，将有望产生协同增效的作用效果，增强肿瘤免疫治疗的效果。脂质体是有效的药物递送载体，可以递送多种药物，增强药物稳定性，减少毒副作用，还可以增强药物在体内分布的靶向性。设计靶向配体修饰的，靶向特定位置的主动靶向脂质体，可以进一步增强药物的靶向性，增强治疗效果降低毒副作用。目前，国内现有技术多是将包载过氧化氢酶的脂质体与游离aPDL1组合使用，这样既增加了给药次数，给临床应用增加困难，同时也无法改善游离aPDL1的靶向性，继而无法增加其有效性减少毒副作用。国内仍未报道脂质体与PD-L1、过氧化氢酶的结合运用，也未曾报道相应组合物质在制备肿瘤治疗药物的应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术目的是提供包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用，其可以有效缓解肿瘤区域低氧同时阻断肿瘤抑制性信号通路(PD-1/PD-L1)，对黑色素瘤有较好的治疗作用。本专利技术设计的多功能免疫脂质体，将CAT与aPDL1有机结合，采用脂质体作为载体共同递送，能够有效解决现有问题，增强肿瘤免疫治疗的效果。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用。进一步地，所述脂质体是一种以大豆磷脂，胆固醇为骨架的包载了过氧化氢酶并且表面连接有aPDL1的多功能免疫脂质体。更进一步地，所述脂质体通过薄膜分散/后插入法制备；所述过氧化氢酶包载在脂质体当中；所述aPDL1是通过反应合成aPDL1导向化合物，插入脂质体磷脂双分子层中；所述脂质体表面还连接有腙键。更进一步地，所述脂质体为球形结构，粒径为118.2±1.763nm，多分散系数为0.223±0.007；过氧化氢酶的包封效率为30-36％。进一步地，所述脂质体的制备方法包括以下步骤：1)通过薄膜分散法制备包载过氧化氢酶的长循环脂质体，利用溶解有过氧化氢酶的PBS溶液进行水化的脂质薄膜；2)通过薄膜分散/后插入法制备免疫脂质体：原料导向化合物与aPDL1混合，合成aPDL1导向化合物；将合成的aPDL1导向化合物与包载过氧化氢酶的长循环脂质体混合搅拌，室温下孵育4h，即可得到免疫脂质体。更进一步地，所述薄膜分散法包括以下步骤：1.1)原料大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000，溶解于氯仿中，摩尔比为100:50:8；1.2)利用旋转蒸发仪将氯仿溶液悬干，去除掉氯仿溶液，得到脂质薄膜；1.3)将脂质薄膜用磷酸缓冲液(PBS)水化；1.4)通过200nm聚碳酸酯膜过滤后得到脂质体。更进一步地，步骤1)中，所述制备包载过氧化氢酶的脂质体使用溶解有1.5mg/ml过氧化氢酶的PBS溶液。更进一步地，步骤2)中，所述原料导向化合物与aPDL1以摩尔比10:1的比例混合；原料导向化合物与aPDL1通过抗体aPDL1的氨基与原料导向化合物的琥珀酰亚胺基反应，合成aPDL1导向化合物；将aPDL1导向化合物与包载过氧化氢酶的脂质体以摩尔比1:100的比例混合搅拌。更进一步地，步骤2)中，还包括多余的aPDL1与过氧化氢酶通过透析法除去的步骤。进一步地，所述肿瘤为黑色素瘤；进一步地，所述脂质体通过以下任一种或一种以上机制实现：A.与肿瘤细胞表面的PD-L1受体结合阻断PD-1/PD-L1信号通路；B.改善肿瘤的低氧状态C.通过受体介导主动靶向途径以及EPR效应，靶向性地浓集于肿瘤组织；D.促进CD8+T淋巴细胞对肿瘤组织的浸润和对肿瘤细胞杀伤，增强免疫治疗的效果；E.aPDL1和过氧化氢酶的组合产生协同治疗作用有效抑制了肿瘤生长。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术所制备的脂质体表面连接有aPDL1，与肿瘤细胞表面的PD-L1受体结合阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强免疫治疗作用；2)本专利技术所制备的脂质体当中包载了过氧化氢酶(CAT)，可以有效缓解肿瘤区域低氧状态；3)本专利技术所制备的脂质体可以阻断PD-1/PDL1信号通路，同时将CAT递送到肿瘤区域，缓解肿瘤低氧，具有最理想的靶向能力，aPDL1s和CAT的协同治疗作用，从而促进CD8+T淋巴细胞对肿瘤组织的浸润和对肿瘤细胞杀伤，增强免疫治疗的效果。附图说明图1为CAT@aPDL1-SSL的结构及作用机制图；图2为实施例2中CAT@aPDL1-SSL的表征图；图中：A为通过DLS确定的CAT@aPDL1-SSL的粒径分布；B为通过TEM观察的形态图像，比例尺：100nm；C为通过便携式溶解氧计检测到的H2O2溶液中O2的浓度；D为蛋白酶K处理(0.5mg/mL)后不同时间点的游离CAT和CAT@aPDL1-SSLs的相对酶活力。图3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用。/n

【技术特征摘要】
1.包载过氧化氢酶且连接PD-L1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂质体是一种以大豆磷脂，胆固醇为骨架的包载了过氧化氢酶并且表面连接有aPDL1的多功能免疫脂质体。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脂质体通过薄膜分散/后插入法制备；所述过氧化氢酶包载在脂质体当中；所述aPDL1是通过反应合成aPDL1导向化合物，插入脂质体磷脂双分子层中；所述脂质体表面还连接有腙键。


4.根据权利要求2所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体为球形结构，粒径为118.2±1.763nm，多分散系数为0.223±0.007；过氧化氢酶的包封效率为30-36％。


5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脂质体的制备方法包括以下步骤：
1)通过薄膜分散法制备包载过氧化氢酶的长循环脂质体，利用溶解有过氧化氢酶的PBS溶液进行水化的脂质薄膜；
2)通过薄膜分散/后插入法制备免疫脂质体：
原料导向化合物与aPDL1混合，合成aPDL1导向化合物；
将合成的aPDL1导向化合物与包载过氧化氢酶的长循环脂质体混合搅拌，室温下孵育4h，即可得到免疫脂质体。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述薄膜分散法包括以下步骤：
1.1)原料大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏世成，黑玉，滕彬宏，熊春阳，陈庆林，
申请(专利权)人：北京大学，北京泓信干细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11