扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法。引物设计流程主要基于Primer3软件进行设计，利用本发明专利技术提供的扩增子测序用引物的设计方法，对于距离正常的靶位点和距离非正常的靶位点分别进行不同的处理设计，减少非特异性扩增，设计出的引物具有特异性较强的性质。

The design of primers for PCR sequencing and the construction of PCR Library

【技术实现步骤摘要】
扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及扩增子测序用引物的设计及扩增子测序文库的构建方法。
技术介绍
扩增子测序是一种高靶向性的目标区域测序方法，利用设计的引物序列靶向地捕获目标区域，然后进行高通量测序(NGS)，分析测序结果，得到相应信息。扩增子测序由于自主地引物设计使得扩增反应高度灵活，目前已经成为基因测序领域的热门选择。因此成功设计出引物是决定扩增子测序实验成功与否的关键，是实验的前提条件和重要流程。现有的扩增子测序引物设计方法对于引物设计细节描述不清，缺少针对特殊位点的有效设计方法，且可设计的扩增子重数相对较少。本专利技术对特殊位点提供处理方法，同时提供超高重扩增子引物panel筛选方法。能够高效针对所需的位点进行引物设计，引物重数高，非特异性扩增及引物二聚体少，克服了现有引物设计方法的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供扩增子测序用引物的设计方法。本专利技术的另一目的是提供扩增子测序文库的构建方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种扩增子测序用引物的设计方法，基于Primer3软件进行引物设计，所述方法包括以下步骤：A、用户准备如下文件：参考基因组序列文件(Reference.fa)、SNP位点物理位置文件和物种各条染色体长度信息文件；B、运行Primer3软件生成参考基因组索引文件(reference.fa.myfasteridx)，按照用户指定长度从参考基因组上获取SNP位点侧翼序列；C、根据两个SNP位点之间的距离，分成以下三种情况进行处理：处理1：若两个SNP位点间距离≥ND(NormalDistance)，软件执行用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core，将此类型SNP位点的引物设计结果写入文件Primer3_output.txt；处理2：若存在临近位点，两个SNP位点间距离＜CD(CloseDistance)，多个SNP中两端SNP间的距离＜BD(BadDistance)，则将这些SNP位点所在区段作为靶标区域，按照用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core；并将结果继续写入文件Primer3_output.txt；处理3：若两个SNP位点间距离＜CD(CloseDistance)，多个SNP中两端SNP间的距离＞BD(BadDistance)，软件生成此类SNP所在区段的侧翼序列文件sequences_badsites.fa；根据fasta序列标题行提供的SNP位点在序列中的相对位置，用户根据其相对位置对多个SNP位点进行取舍，自行制定参数，用软件Primer3针对每组SNP位点进行引物设计；D、按照如下原则设计特异性多重PCR引物：d1.引物序列与基因组进行比对：筛选比对到参考基因组唯一位置上的引物；d2.引物间的比对：保留彼此间不会形成引物二聚体的引物；d3.扩增产物大小为180-400bp；对满足上述d1～d3的引物进行人工校正，即得扩增子测序用引物。本专利技术中，ND表示2倍指定侧翼序列长度，CD表示不放在一条序列上进行引物设计的两个SNP位点间距值，BD表示同一序列上间距最远的两个SNP位点间距值。优选地，步骤d2中，引物筛选原则为：引物末端10bp与其他引物之间无互补区。第二方面，本专利技术提供按照上述方法获得的肉牛扩增子测序用引物，引物序列如SEQIDNO：1-200所示。第三方面，本专利技术提供按照上述方法设计的引物在扩增子测序文库构建中的应用。第四方面，本专利技术提供扩增子测序文库的构建方法，所述方法包括：1)按照上述方法设计扩增子测序用引物；2)提取待测样品基因组DNA作为模板，利用步骤1)设计的引物进行PCR反应，回收并纯化PCR产物。步骤2)中PCR反应体系：DNA模板22μL，PCREnzymeMix45μL，PCRPrimerMix10μL，不含RNase的ddH2O(NF水)23μL。PCR反应条件：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，7个循环；72℃10min。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：利用本专利技术提供的扩增子测序用引物的设计方法，对于距离正常的靶位点(SNP位点)和距离非正常的靶位点分别进行不同的处理设计，减少非特异性扩增，设计出的引物具有特异性较强的性质。附图说明图1为本专利技术实施例1中引物设计流程图。图2为本专利技术实施例1中软件运行示例。图3为本专利技术实施例1中肉牛参考基因组序列文件图4为本专利技术实施例1中肉牛各条染色体长度文件。图5为本专利技术实施例1中肉牛靶位点文件。图6为本专利技术实施例1中肉牛参考基因组索引文件提示。图7为本专利技术实施例1中在针对同一以基因组文件在此目录下非首次运行该程序时，生成的提示。图8为本专利技术实施例1中输入primer3_core相关参数。图9为本专利技术实施例1中PCR扩增产物的电泳结果。其中，M为DNA分子量标准，1为PCR扩增产物。具体实施方式本专利技术提供一种扩增子测序用引物的设计方法，设计流程主要分为两部分：引物设计和引物筛选，具体方法如下：一、引物设计流程本专利技术中引物设计流程主要基于Primer3软件进行设计，用户需要准备如下文件：(1)参考基因组序列文件(Reference.fa)；(2)靶位点物理位置文件；(3)物种各条染色体长度信息文件；软件运行过程中会生成参考基因组索引文件(reference.fa.myfasteridx)，使其可以按照用户指定长度从基因组上获取靶位点侧翼序列。因SNPs在染色体上间距分布不等，根据两个SNP之间的距离，会分成3种情况进行处理：处理1：若两个SNP位点间距离≥ND(NormalDistance)，软件执行用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core，将此类型SNP位点的生物设计结果写入文件(Primer3_output.txt)；处理2：若存在临近位点：两个SNP位点间的距离＜CD(CloseDistance)，多个SNPs中两端SNP间的距离＜BD(BadDistance)，则将这些SNPs位点所在区间段作为靶标区域，按照用户所输入引物设计相关参数，调用primer3_core；并将结果继续写入文件(Primer3_output.txt)；处理3：若两个SNP位点间的距离＜CD(CloseDistance)，多个SNPs中两端SNP间的距离＞BD(BadDistance)软件会给出此类SNPs所在区间的侧翼序列(sequences_badsites.fa)，此fasta序列标题行会给出位点在序列中的相对位置，用户可根据其相对位置对多个SNP位点进行取舍，自行制定参数，使用网页版Primer3针对每组位点进行引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.扩增子测序用引物的设计方法，其特征在于，基于Primer3软件进行引物设计，所述方法包括以下步骤：/nA、用户准备如下文件：参考基因组序列文件、SNP位点物理位置文件和物种各条染色体长度信息文件；/nB、运行Primer3软件生成参考基因组索引文件，按照用户指定长度从参考基因组上获取SNP位点侧翼序列；/nC、根据两个SNP位点之间的距离，分成以下三种情况进行处理：/n处理1：若两个SNP位点间距离≥ND，软件执行用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core，将此类型SNP位点的引物设计结果写入文件Primer3_output.txt；/n处理2：若存在临近位点，两个SNP位点间距离＜CD，多个SNP中两端SNP间的距离＜BD，则将这些SNP位点所在区段作为靶标区域，按照用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core；并将结果继续写入文件Primer3_output.txt；/n处理3：若两个SNP位点间距离＜CD，多个SNP中两端SNP间的距离＞BD，软件生成此类SNP所在区段的侧翼序列文件sequences_badsites.fa；根据fasta序列标题行提供的SNP位点在序列中的相对位置，用户根据其相对位置对多个SNP位点进行取舍，自行制定参数，用软件Primer3针对每组SNP位点进行引物设计；/nD、按照如下原则设计特异性多重PCR引物：/nd1.引物序列与基因组进行比对：筛选比对到参考基因组唯一位置上的引物；/nd2.引物间的比对：保留彼此间不会形成引物二聚体的引物；/nd3.扩增产物大小为180-400bp；/n对满足上述d1～d3的引物进行人工校正，即得扩增子测序用引物；/n所述步骤C中，ND表示2倍指定侧翼序列长度，CD表示不放在一条序列上进行引物设计的两个SNP位点间距值，BD表示同一序列上间距最远的两个SNP位点间距值。/n...

【技术特征摘要】
1.扩增子测序用引物的设计方法，其特征在于，基于Primer3软件进行引物设计，所述方法包括以下步骤：
A、用户准备如下文件：参考基因组序列文件、SNP位点物理位置文件和物种各条染色体长度信息文件；
B、运行Primer3软件生成参考基因组索引文件，按照用户指定长度从参考基因组上获取SNP位点侧翼序列；
C、根据两个SNP位点之间的距离，分成以下三种情况进行处理：
处理1：若两个SNP位点间距离≥ND，软件执行用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core，将此类型SNP位点的引物设计结果写入文件Primer3_output.txt；
处理2：若存在临近位点，两个SNP位点间距离＜CD，多个SNP中两端SNP间的距离＜BD，则将这些SNP位点所在区段作为靶标区域，按照用户输入的引物设计相关参数，调用primer3_core；并将结果继续写入文件Primer3_output.txt；
处理3：若两个SNP位点间距离＜CD，多个SNP中两端SNP间的距离＞BD，软件生成此类SNP所在区段的侧翼序列文件sequences_badsites.fa；根据fasta序列标题行提供的SNP位点在序列中的相对位置，用户根据其相对位置对多个SNP位点进行取舍，自行制定参数，用软件Primer3针对每组SNP位点进行引物设计；
D、按照如下原则设计特异性多重PCR引物：
d1.引物序列与基因组进行比对：筛选比对到参考基因组唯一位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继强，
申请(专利权)人：北京康普森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11