单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法技术

本发明专利技术公开了单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，包括有以下步骤：步骤一：确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制Taqman OpenArray芯片进行基因分型；步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；步骤三：对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选；步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，本发明专利技术涉及生物遗传医学技术领域。本发明专利技术，能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的。

Detection of smoking addiction in Han population by single nucleotide polymorphism

【技术实现步骤摘要】
单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法
本专利技术涉及生物遗传医学
，具体涉及中国汉族人群吸烟成瘾易感基因单核苷酸多态性位点检测试剂盒及其应用。
技术介绍
吸烟成瘾作为一种慢性精神类疾病，全球范围内每年约造成600万人的非正常死亡。由于缺少有效的治疗方法和戒烟手段，以及一些国家和地区对于吸烟成瘾的危害认识有限，在2020年每年因为吸烟导致的非正常死亡人数将达到1000万人。根据中国疾控中心报告显示，在2015年中国有过吸烟经历的成年男性比例高达52.1％，烟民总数超过3亿，6000万人每天吸烟量超过1包，由于吸烟导致非正常死亡的人数高达130万。由于吸烟带来的经济损失在2014年约为3500亿元。数据显示，中国烟民戒烟成功率仅14.4％，而如果仅靠个人意志不借助医疗戒烟的话，成功率仅有3％-5％。在过去的几十年中，连锁分析、候选基因关联分析以及全基因组关联分析的广泛应用，为吸烟成瘾找到了大量的易感位点。对于吸烟成瘾来说，遗传因素和环境因素都起到了重要的作用。其中，遗传因素对于吸烟成瘾的贡献大约为0.56。尽管对于吸烟成瘾这一表型已经经过了几十年的研究，但是最为广泛被大家接受的，还是乙酰胆碱受体家族的CHRNA5/A3/B4基因簇、CHRNB3/A6和尼古丁代谢通路的基因CYP2A6/A7。需要注意的是，这些研究结果也主要是基于欧洲裔和非洲裔的样本所得到的分析结果，而针对于中国汉族人群的吸烟相关的研究还是非常少的。但是，人种之间存在的基因型差异是不可忽略的问题。所以，寻找中国汉族人群特有的吸烟易感位点，不仅对于成瘾治疗药物的开发、精准治疗中国汉族人群吸烟成瘾的现象有重要意义；并且，可以鉴定出易于吸烟成瘾高风险的中国汉族人群，从而建议这些高风险的人群不要接触烟草制品，避免成瘾的发生。候选基因关联分析是国际上使用最为普遍的一种算法，用于找到和表型最相关的单核苷酸多态性位点。我们使用软件PLINK(v.1.07)，结合样本的基因型和表型文件做关联分析，对所纳入的遗传位点根据关联分析的P值进行第一次的筛选。对于候选基因分析的方法，我们只局限于单个位点的扫描，找到显著的单核苷酸多态性位点，对其进行生物学解释。但是这样单一的分析，造成了遗传力的缺失，很多不够显著的位点从而被忽略，这一现象也解释了遗传力丢失的现象。现在，我们将构建广义线性回归模型，结合表型，可以探索到全基因组范围内多个基因的协同效应对表型产生的影响，检测其基因上位性，为进一步研究的吸烟成瘾等复杂疾病的遗传起因找到真正的单核苷酸多态性位点。结合候选基因的基因组、转录组和甲基化组数据，使用软件MatrixeQTL(v.2.1.1)进行cis-mQTL和cis-eQTL分析，我们可以进一步缩小研究范围，找到中国汉族人群中的成瘾相关的功能性遗传位点，而不是单纯只考虑关联分析结果中的P值，也可以为更多位于内含子区间的单核苷酸多态性位点解释其生物学功能。最终，通过生物信息学软件Polyphen和CADD进行单核苷酸多态性位点功能预测，找到最优的中国汉族人群中的吸烟成瘾相关的易感位点rs2304297(G)、rs1072003(C)、rs16969968(A)，组成检测所需的基因检测试剂盒。因此，本专利技术申请提供了单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的。
技术实现思路
为了能够精准、有效地为判断中国汉族人群吸烟成瘾易感性提供依据和指导，从而避免高风险个体直接或者过多的接触烟草产品，达到精准预防的目的，本专利技术的目的是提供单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，包括有以下步骤：步骤一：通过搜索查阅数据库以及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制TaqmanOpenArray芯片进行基因分型；步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；步骤三：基于基因分型的结果，结合样本吸烟相关的表型，利用候选基因关联分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，将关联分析P值小于0.05的单核苷酸多态性位点纳入下一步分析；步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，对单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟成瘾具有贡献并具有潜在生物学意义的位点，构成中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒。优选的，所述步骤一中，通过搜索查阅数据库及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点为：1)提供了一组与吸烟成瘾相关的18个候选基因；A.尼古丁受体家族的基因：CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5、CHRNB3-CHRNA6、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；B.尼古丁代谢的相关基因：CYP2B6；C.神经递质系统中的相关基因：GRIN3A、DRD2-ANKK1-TTC12-NCAM1、HTR3A、HTR3B、SLC6A4；2)提供了与吸烟成瘾相关的203个单核苷酸多态性位点；3)根据203个单核苷酸多态性位点，将所选择的位点及对应的探针信息提交给ThermoFisherScientific公司，定制TaqmanOpenArray芯片，根据样本的数量和单核苷酸多态性位点数目选择最优的模块组合。优选的，所述步骤二中，，DNA样本用于基因分型实验和甲基化测序，RNA样本用于转录组测序，利用IlluminaX10测序仪为样本进行测序，通过Illumina二代测序，获得样本甲基化和转录组的原始测序数据，之后将18个易感基因±500kb范围内的基因表达水平和甲基化信息提取出来，对于转录组测序下机数据，我们在使用数据之前，首先要对原始数据进行质量控制，删除低质量的样本和序列，避免低质量的结果对之后的分析产生影响，产生假阳性，之后对单个样本进行有参联配、对基因进行组装和定量。使用的软件组合是Hisat2(v.2.1.0)和Stringtie(v.1.3.6)，甲基化测序原理是使用亚硫酸盐处理DNA后，甲基化的胞嘧啶不受影响，非甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，经PCR后转化为胸腺嘧啶，测序并比对到参考基因组上后通过以上原理可区分出胞嘧啶的甲基化状态，使用Bismark(v.0.22.1)和Bowtie2(v.2.3.5.1软件组合来对甲基化序列进行比对和回帖，通过这一步的分析，我们得到了18个吸烟成瘾易感基因上下游500kb范围内所有基因的基因表达水平数据和基因甲基化水平数据。优选的，所述步骤三中，根据步骤一中的203个单核苷酸多态性位点基因型，结合样本吸烟相关的表型信息，矫正年龄以及喝酒等影响因素，构建线性回归模型，找到具有统计学意义的多态性位点，利用候选基因关联分析，对汉族人群中吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于，包括有以下步骤：/n步骤一：通过搜索查阅数据库以及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制Taqman OpenArray芯片进行基因分型；/n步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；/n步骤三：基于基因分型的结果，结合样本吸烟相关的表型，利用候选基因关联分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，将关联分析P值小于0.05的单核苷酸多态性位点纳入下一步分析；/n步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，对单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟成瘾具有贡献并具有潜在生物学意义的位点，构成中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒。/n

【技术特征摘要】
1.单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于，包括有以下步骤：
步骤一：通过搜索查阅数据库以及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点，并定制TaqmanOpenArray芯片进行基因分型；
步骤二：为血液样本提取DNA和RNA；
步骤三：基于基因分型的结果，结合样本吸烟相关的表型，利用候选基因关联分析，对汉族人群中特有的吸烟成瘾易感位点进行初步筛选，将关联分析P值小于0.05的单核苷酸多态性位点纳入下一步分析；
步骤四：基于基因分型、基因组甲基化测序、转录组测序的结果，找出具有潜在生物学功能的单核苷酸多态性位点，对单核苷酸多态性位点进行打分，保留最可能对吸烟成瘾具有贡献并具有潜在生物学意义的位点，构成中国汉族人群吸烟成瘾的基因检测试剂盒。


2.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于：所述步骤一中，通过搜索查阅数据库及之前在欧裔样本的研究结果，确定与吸烟成瘾相关的18个易感基因、203个单核苷酸多态性位点为：
1）提供了一组与吸烟成瘾相关的18个候选基因；
A.尼古丁受体家族的基因：CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5、CHRNB3-CHRNA6、CHRNA2、CHRNB2、CHRNA7、CHRNA4；
B.尼古丁代谢的相关基因：CYP2B6；
C.神经递质系统中的相关基因：GRIN3A、DRD2-ANKK1-TTC12-NCAM1、HTR3A、HTR3B、SLC6A4；
2）提供了与吸烟成瘾相关的203个单核苷酸多态性位点；
3）根据203个单核苷酸多态性位点，将所选择的位点及对应的探针信息提交给ThermoFisherScientific公司，定制TaqmanOpenArray芯片，根据样本的数量和单核苷酸多态性位点数目选择最优的模块组合。


3.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性检测汉族人群吸烟成瘾方法，其特征在于：所述步骤二中，，DNA样本用于基因分型实验和甲基化测序，RNA样本用于转录组测序，利用IlluminaX10测序仪为样本进行测序，通过Illumina二代测序，获得样本甲基化和转录组的原始测序数据，之后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘强，马云龙，李明定，
申请(专利权)人：刘强，马云龙，
类型：发明
国别省市：山西;14