持续过表达IFN-γ的间充质干细胞及其用途制造技术

本发明专利技术属于干细胞技术领域，具体涉及一种持续过表达IFN‑γ的间充质干细胞及其用途。针对现有技术中缺乏有效的预防aGVHD的方法的问题，本发明专利技术提供一种持续过表达IFN‑γ的间充质干细胞，该干细胞含有的重组载体中含有能持续编码IFN‑γ的基因，能够持续过表达IFN‑γ。本发明专利技术的持续过表达IFN‑γ的间充质干细胞制备方法简单，在异基因造血干细胞移植后的机体内同时发挥抗肿瘤及免疫作用，降低aGVHD的发生率或严重程度，同时不影响GVL效应，为异基因造血干细胞移植后aGVHD的预防及治疗提供一类新方法。本发明专利技术的表达载体表达效率更高，感染的效率更高，表达的稳定性更好。

Mesenchymal stem cells persistently overexpressing IFN - \u03b3 and its application

【技术实现步骤摘要】
持续过表达IFN-γ的间充质干细胞及其用途
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种持续过表达IFN-γ的间充质干细胞及其用途。
技术介绍
异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,allo-HSCT)的主要特征是供者T淋巴细胞等免疫细胞的激活，通过免疫机制，最大化地消灭受者残存的白血病细胞，以期达到移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia,GVL)。而供者T细胞在受者体内激活，常会引起急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease,aGVHD)，是allo-HSCT最严重的并发症，严重影响移植成功率。其发生机理主要是供者T细胞通过激活抗原呈递细胞和诱导细胞因子的释放作用于受者细胞，引起患者皮肤，肺，肝脏等靶器官损伤。目前针对aGVHD的治疗推荐主要在allo-HSCT后的预防，药物包括环孢霉素A、甲氨蝶呤、抗胸腺细胞球蛋白等；而针对已经发生的aGVHD一线用药推荐为甲基强的松龙，二线治疗包括吗替麦考酚酯胶囊、甲氨蝶呤、他克莫司、抗TNF抗体、间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)输注等。但上述方法的临床治疗效果仍不理想。IFN-γ是一种由多种细胞如CD4+Th1细胞、CD8+细胞、NK细胞、B细胞等分泌的多效细胞因子，在免疫调节中具有重要意义，可以通过参与调节免疫应答、调节细胞周期，促进细胞凋亡、抗肿瘤新生血管形成、抗病毒作用及与化学药物组合的协同作用等发挥抗肿瘤作用，如能够通过促进Fas和FasL蛋白表达来抑制白血病K562细胞增殖并促进凋亡。MSCs是一类来源广泛且具有多向分化潜能的多能干细胞，研究证明MSCs因为低表达主要组织性相容复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)Ⅰ类分子，不表达MHCⅡ类分子、FasL、CD80、CD86、CD40、CD40L，具有低免疫原性及免疫调节能力。在aGVHD环境中，MSCs可通过可溶性抗增殖因子：如转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)、可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、血红素氧合酶(HO-1)、前列环素E2(PGE2)、IFN-γ、白细胞介素-10(IL-10)、及人类白细胞抗原-G5(HLA-G5)共同组成免疫抑制微环境，阻断T淋巴细胞的活化、加速T淋巴细胞的凋亡而发挥免疫抑制作用抑制aGVHD的进展。但从目前使用MSCs预防aGVHD的报道来看，治疗效果尚不确定。脐带来源的MSCs由于其原始性、高扩增率、高分化能力、易获取、无伦理争论和菌污染机会小等优势，成为MSCs研究中的优势选择。综上，现有技术中缺乏有效的预防aGVHD的方法，本专利技术拟提供一种持续过表达IFN-γ的人脐带间充质干细胞，以期预防aGVHD的发生或减轻其严重程度，同时不影响GVL效应。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为：现有技术中缺乏有效的预防aGVHD的方法的问题。本专利技术解决技术问题的技术方案为：提供一种持续过表达IFN-γ的间充质干细胞。该间充质干细胞含有的重组载体中含有能持续编码IFN-γ的基因，能够持续过表达IFN-γ。其中，上述持续过表达IFN-γ的间充质干细胞中，所述的持续编码IFN-γ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。SEQIDNO:1IFN-γ的核苷酸序列atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcgaggtcgaagagcatcccagtag。其中，上述持续过表达IFN-γ的间充质干细胞中，所述的重组载体为病毒载体。进一步的，所述的病毒载体为慢病毒载体。其中，上述持续过表达IFN-γ的间充质干细胞中，所述的间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。本专利技术还提供了一种上述持续过表达IFN-γ的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达IFN-γ的慢病毒载体，并包装病毒颗粒；复苏冻存的第3代人脐带间充质干细胞，换液、培养、传代后，选择第5代处于对数生长期的人脐带间充质干细胞，细胞生长至80～90％汇合时，用胰酶消化并计数，37℃、5％CO2条件下培养过夜；病毒颗粒感染细胞，37℃、5％CO2条件下培养24h后换液，48h后更换为筛选培养基，37℃、5％CO2条件下培养，即获重组基因修饰的间充质干细胞。进一步的，所述的筛选培养基为含1ug/ml嘌呤霉素的DMEM/F12完全培养基。本专利技术还提供了一种上述持续过表达IFN-γ的间充质干细胞在预防或治疗急性移植物抗宿主病中的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术构建了一种持续表达IFN-γ的慢病毒载体，感染人脐带间充质干细胞，得到一种能持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，并研究了IFN-γ在HuMSCs免疫调节中的作用机制，首次发现重组修饰后的间充质干细胞在异基因造血干细胞移植后的机体内同时发挥抗肿瘤及免疫作用，降低急性移植物抗宿主病的发生率或严重程度，同时不影响GVL效应，为异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的预防及治疗提供一类新方法。本专利技术的表达载体表达效率更高，感染的效率更高，表达的稳定性更好。附图说明图1所示为重组慢病毒载体质粒PCDH-hIFN-γ酶切鉴定结果；图2所示为QPCR检测hIFN-γ的表达结果；转干扰素-γ组与对照组相比，P<0.05，有统计学意义，同时空载组与对照组相比，P>0.05，二者无显著差异；图3所示为ELISA法检测hIFN-γ蛋白的表达结果；转干扰素-γ组与对照组相比，P<0.05，hIFN-γ的浓度为(459.9+2.232pg/ml)，而空载组与对照组相比，P>0.05，无明显差异；图4所示为HuMSCs与T淋巴细胞共培养结果；与单独T细胞组相比，对照组(0.7707+0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：该间充质干细胞含有的重组载体中含有能持续编码IFN-γ的基因，能够持续过表达IFN-γ。/n

【技术特征摘要】
1.持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：该间充质干细胞含有的重组载体中含有能持续编码IFN-γ的基因，能够持续过表达IFN-γ。


2.根据权利要求1所述的持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：所述的持续编码IFN-γ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1所述的持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：所述的重组载体为病毒载体。


4.根据权利要求3所述的持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：所述的病毒载体为慢病毒载体。


5.根据权利要求1所述的持续过表达IFN-γ的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。


6.权利要求1～5任一项所述的持续过表...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾永前，陈影影，吴鹏强，王甫珏，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51