一种活性寡肽的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种寡肽的制备方法：将蛋白质溶液预酶解；再进行首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解后获得透过液1；透过液1进入超滤设备2，加入复合蛋白酶II酶解后获得透过液2；透过液2进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液（含寡肽的溶液），透过液3流回至超滤设备1；然后重复循环：持续向超滤设备1补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1、透过液2、透过液3和流出液；流出液中寡肽浓度小于设定阈值，再次泵入预酶解液。本发明专利技术的制备方法，通过两种复合蛋白酶和串联式超滤偶联酶解，控制了蛋白和多肽的水解程度，最大程度提取寡肽，提高原料利用率。该制备方法步骤简单，获得的产品寡肽含量高、收率高，适于工业化生产。

A preparation method of active oligopeptide

【技术实现步骤摘要】
一种活性寡肽的制备方法
本专利技术属于寡肽制备领域，涉及一种抗氧化寡肽的制备方法，具体涉及一种以大米蛋白为原料制备抗氧化寡肽的方法。
技术介绍
我国稻米资源丰富，产量居世界首位。大米蛋白中氨基酸组成平衡，配比合理，接近FAO/WHO推荐的理想模式。大米蛋白经蛋白酶水解成短肽或氨基酸后，可以制成营养价值更高的多肽产品，而进一步用于保健品、饮料、调味品、化妆品等行业。稻谷在加工生产过程中产生约15%的碎米，碎米的蛋白含量接近8%，其营养价值与大米相近，但价格仅为大米的1/3-1/2。目前碎米大多用于米粉、饲料、酿酒、味精生产等，附加值较低。通过碎米生产高品质的大米蛋白产品，或者进一步通过大米蛋白生产附加值更高的活性多肽产品，不仅会提高碎米的综合利用水平，同时也将会大大提高企业的经济效益。目前，以碎米为原料制备生物活性肽的专利技术较多，其中CN102229643A以大米或碎米为原料，在碱提酸沉方法制备大米蛋白粗品的基础上，通过由淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶组成的高效复合酶的除杂作用去除其中的非蛋白类物质，制备蛋白含量高于90％的高纯度大米蛋白，并进一步在此基础上通过复合蛋白酶作用和交替式酶解超滤偶联技术，控制大米蛋白的水解程度，分离制备得到蛋白含量高于90％、多肽含量高于70％、200-1200Da寡肽含量高于50％的蛋白高纯度大米肽。CN101253925A以大米为原料，经粉碎、碱溶酸沉、离心分离、上清液等电点沉淀、沉淀洗涤、加水匀质后再经中性蛋白酶水解、离心分离、上清液经冷冻干燥得到了分子量分布范围在392-1367Da，具有抗氧化活性的大米蛋白肽。CN102876762A将碎米超微粉碎，加水及碳酸氢钠调配并发生酶解反应，固液分离后制备大米淀粉及大米蛋白。CN109880874A中将大米蛋白粉、水和复合蛋白酶混合后水解，得到水解物；将水解物依次进行压滤、陶瓷膜过滤、纳滤，得到小分子蛋白肽溶液，干燥，得到大米活性肽。CN105349607A将酶解过程和多级超滤串联同步连续酶解制备甘露醇聚肽，获得魔芋飞粉甘露醇聚肽的提取率达2-3%，纯度达70-75%。可见，现有技术中虽然获得的寡肽纯度最高能够达到70%左右，但是酶解控制过程差，或者多肽含量高、需要反复酶解、步骤繁琐、成本高，或者酶解过度、氨基酸含量高，导致最终得率低。
技术实现思路
针对目前寡肽制备过程中酶解控制差、寡肽得率低的问题，本专利技术提供一种抗氧化寡肽的制备方法，能够控制酶解过程，获得的产品寡肽含量高、收率高，步骤简便，获得的寡肽抗氧化活性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种寡肽的制备方法，包括以下步骤：（1）将蛋白质溶液与复合蛋白酶I混合后在酶解反应器中预酶解，获得预酶解液；（2）首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解一段时间后开启超滤设备1，获得透过液1；透过液1进入超滤设备2至一定量，加入复合蛋白酶II，酶解一段时间后开启超滤设备2，获得透过液2；透过液2进入纳滤设备进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；（3）重复循环：超滤设备1开启后持续补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液；（4）流出液中寡肽浓度小于设定阈值时，超滤设备1中再次泵入预酶解液。步骤（1）中，所述蛋白质溶液的浓度为5-15mg/mL。所述蛋白质溶液的pH为6-9。所述蛋白质溶液的溶剂选自NaOH溶液、Britton-Robinson广泛缓冲溶液、PB缓冲溶液、PBS缓冲溶液。所述蛋白质来源为植物；优选为谷物；更优选为大米。所述复合蛋白酶I包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶；其用量分别为1000-2000U/g蛋白、1500-2500U/g蛋白和1500-2500U/g蛋白。步骤（1）中，预酶解的条件为：40-60℃，20-60min。步骤（2）中，超滤设备1中酶解的条件为：40-60℃，10-30min。超滤设备2中酶解的条件为：40-60℃，5-20min。步骤（2）中，超滤设备1的超滤膜截留分子量为4000-6000Da。超滤设备2的超滤膜截留分子量为1500-2500Da。纳滤膜截留分子量200Da。所述复合蛋白酶II包括木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和端肽酶；其用量分别是1000-2000U/g蛋白、1000-2000U/g蛋白和500-1500U/g蛋白。步骤（2）中，所述超滤膜选自切向流板式膜、卷式膜或中空纤维膜；优选为切向流板式膜。所述超滤膜的材料选自再生纤维素膜或聚砜膜；优选为再生纤维素膜。步骤（4）中，所述阈值为0.1mg/mL。优选的，上述方法还包括将流出液浓缩或干燥获得产品的步骤。一种上述方法获得的寡肽。一种含上述寡肽的化妆品或保健食品。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种高纯度寡肽的制备方法，以植物蛋白为原料，通过两种复合蛋白酶和串联式超滤偶联酶解技术，控制蛋白和多肽的水解程度，最大程度的提取寡肽，提高原料的利用率。本专利技术通过对复合蛋白酶I和复合蛋白酶II的优化组合提高大米蛋白水解率，复合蛋白酶I将蛋白酶解成大分子肽，复合蛋白酶II将大分子肽进一步酶解成小分子肽，酶解过程更具针对性，酶解效率更高。本专利技术中预酶解液以一定的时间间隔进入串联的超滤装置，通过控制预酶解时间、超滤间隔时间，最大限度的提升蛋白的水解程度，定向生产寡肽，又可以及时将生成的寡肽与酶分离，避免寡肽被进一步水解。本专利技术获得的寡肽产品中寡肽的含量高于80%，寡肽收率大于3.8%，其对对DPPH自由基清除的IC50小于1.5mg/mL。本专利技术提供的抗氧化寡肽的制备方法，能够控制酶解过程、步骤简单，获得的产品寡肽含量高、收率高，适于工业化生产。附图说明图1是实施例寡肽制备过程流程示意图；图2是多肽分子量校正标准曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1大米蛋白的制备（1）蛋白提取：取10kg碎米，粉碎至60目，加入100L水搅拌均匀，调pH至13，置于50℃水浴锅中，水浴搅拌3h，5000r/min离心20min，保留上清液，用0.1MHCl调pH至5.5，于4℃静置30min，收集蛋白沉淀，经冷冻干燥、粉碎得到粗大米蛋白。（2）蛋白除杂：按料液比1:10加水搅拌均匀，调pH至5.5，置于55℃水浴锅中，按照粗蛋白的量添加35U/g淀粉酶和10U/g纤维素酶，水浴搅拌3h，5000r/min离心20min，收集蛋白沉淀，经冷冻干燥、粉碎得到大米蛋白512.4g，蛋白得率为5.12%。实施例2抗氧化寡肽的制备（1）取实施例1中制备的大米蛋白，加pH7.5的PBS缓冲液配制成10L浓度为10mg/mL的蛋白溶液，搅拌均匀，置于55℃酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将蛋白质溶液与复合蛋白酶I混合后在酶解反应器中预酶解，获得预酶解液；/n（2）首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解一段时间后开启超滤设备1，获得透过液1；/n透过液1进入超滤设备2至一定量，加入复合蛋白酶II，酶解一段时间后开启超滤设备2，获得透过液2；/n透过液2进入纳滤设备进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；/n（3）重复循环：超滤设备1开启后持续补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液；/n（4）流出液中寡肽浓度小于设定阈值时，超滤设备1中再次泵入预酶解液。/n

【技术特征摘要】
1.一种寡肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蛋白质溶液与复合蛋白酶I混合后在酶解反应器中预酶解，获得预酶解液；
（2）首次过滤：将预酶解液泵入超滤设备1，酶解一段时间后开启超滤设备1，获得透过液1；
透过液1进入超滤设备2至一定量，加入复合蛋白酶II，酶解一段时间后开启超滤设备2，获得透过液2；
透过液2进入纳滤设备进行纳滤，获得透过液3和流出液，收集流出液，流出液即含寡肽的溶液，透过液3流回至超滤设备1；
（3）重复循环：超滤设备1开启后持续补充蛋白质溶液的溶剂，持续获得透过液1；透过液1持续进入超滤设备2，持续获得透过液2；透过液2持续进入纳滤设备，持续获得透过液3和流出液；
（4）流出液中寡肽浓度小于设定阈值时，超滤设备1中再次泵入预酶解液。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述蛋白质溶液的浓度为5-15mg/mL；
所述蛋白质来源为植物；优选为谷物；更优选为大米。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述蛋白质溶液的pH为6-9；
所述蛋白质溶液的溶剂选自NaOH溶液、Britton-Robinson广泛缓冲溶液、PB缓冲溶液、PBS缓冲溶液。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶I包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶；其用量分别为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，杨桂兰，耿凤，魏健，郭学平，刘爱华，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37