一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)将未成熟的青皮木瓜进行破碎处理，将破碎后的木瓜加入到由乙二胺四乙酸、氯化钠和半胱氨酸盐酸盐组成的溶液中进行充分混合；(2)将混合液中不溶的皮渣过滤掉，将过滤后得到的滤液在3‑10℃环境下经离心、冷冻干燥后得到木瓜乳汁粗提酶；(3)将木瓜乳汁粗提酶加入到由成相剂、萃取辅助剂组成的四元双水相体系中，经充分混合后，静止待形成明显的上下相，含酶的萃取液位于上相，回收上相，对上相萃取液进行超滤处理；(4)对超滤后的液体进行浓缩处理；浓缩液经冷冻干燥后，获得纯净的木瓜蛋白酶。使用该方法可以获得较高的产品纯度和回收率，适合工业推广应用。

Preparation of papain by two-phase aqueous extraction combined with ultrafiltration

【技术实现步骤摘要】
一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法
本专利技术涉及蛋白酶提取领域，具体而言，涉及一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法。
技术介绍
木瓜蛋白酶是切割青木瓜提取出来的含巯基(-SH)的肽链内切酶，由212个氨基酸残基组成，具有耐高温、稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，在食品、化妆品、医药业、饲料皮革和纺织业有广泛的应用。目前，工业上应用的“木瓜蛋白酶”大都是番木瓜乳汁粗制品，除含木瓜蛋白酶外，还含有木瓜凝乳酶、溶菌酶、纤维素酶及低分子量的巯基化合物。高品质的木瓜蛋白酶基本靠进口，且传统方法制备木瓜蛋白酶存在纯度不高，规模化困难等不足，难以达到现代工业的需求。双水相萃取技术使用的设备简单，含水量高，具有很好的生物相容性，室温条件下即可获得较高的产品纯度和回收率，易于扩大生产，近年来，已广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离和纯化。聚乙二醇(PEG)被用作双水相的成相剂是由于它较高的水溶性，低熔点，低毒，低成本和很好的生物降解性。离子液体(ILs)，又称为室温熔融盐，通常由一类非对称的有机阳离子和一类有机或无机阴离子构成，这种新型的绿色溶剂有很多“绿色”的特点，如较高的热稳定型和化学稳定性，不易燃性，可忽略的挥发性及可通过改变阴阳离子的组装很好地调节离子液体的特性的特点。而且，离子液体的这种“可调节性”使得离子液体这种独特的化合物可以被设计成满足特定过程的精确条件，操纵它们对特定生物分子的提取能力。传统的双水相系统包括典型的聚合物/盐，或者聚合物/聚合物及有机溶剂/盐组合而成的双水相体系。然而，这些方法有着各种各样的不足，如操作复杂、粘度高、不确定的安全性等。目前，国内的双水相萃取酶的研究主要集中在IL-盐和PEG-盐双水相系统。然而，富含PEG相极低较低的极性和PEG自身只能通过改变分子量来改变双水相体系的特点限制了它的应用范围；离子液体虽然有很多优点，但是，购买离子液体的成本较高，单独使用离子液体对于规模化生产在一定程度上增加了生产成本。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，是利用双水相体系PEG400+(NH4)2SO4+H2O+4wt％ILs的木瓜蛋白酶的分离纯化技术，可以获得较高的产品纯度和回收率，适合工业推广应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将未成熟的青皮木瓜进行破碎处理，将破碎后的木瓜加入到由乙二胺四乙酸、氯化钠和半胱氨酸盐酸盐组成的溶液中进行充分混合；(2)将混合液中不溶的皮渣过滤掉，将过滤后得到的滤液在3-10℃环境下经离心、冷冻干燥后得到木瓜乳汁粗提酶；(3)将木瓜乳汁粗提酶加入到由成相剂、萃取辅助剂组成的四元双水相体系中，经充分混合后，静止待形成明显的上下相，含酶的萃取液位于上相，回收上相，对上相萃取液进行超滤处理；(4)对超滤后的液体进行浓缩处理；浓缩液经冷冻干燥后，获得纯净的木瓜蛋白酶。进一步地，所述的步骤(1)中，EDTA(乙二胺四乙酸)浓度为0.2mmol/L，NaCl浓度为1mmol/L，半胱氨酸盐酸盐浓度为0.04mol/L。具体的，步骤1)中破碎处理使用破碎机；具体的，步骤4)中，超滤处理采用过滤机，选择可滤过10000Da的超滤机，浓缩处理采用真空浓缩机。进一步地，所述的步骤(3)中，(NH4)2SO4、PEG400作为成相剂，[N1111]Br作为萃取辅助剂。进一步地，所述的步骤(3)中，四元双水相体系(NH4)2SO4浓度为18～25wt％，PEG400浓度为18～25wt％，[N1111]Br浓度为3～5wt％。进一步地，所述(NH4)2SO4浓度为20.20wt％，PEG400浓度为20.25wt％，[N1111]Br浓度为4wt％。进一步地，所述的步骤(3)中，四元双水相体系PH为6～8。进一步地，所述四元双水相体系PH为7。进一步地，所述的步骤(3)中，木瓜蛋白酶的萃取温度为50～70摄氏度。进一步地，木瓜蛋白酶的萃取温度为60摄氏度。本专利技术所述双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法与现有技术相比有益效果为：1.本专利技术所述木瓜蛋白酶制备方法具有工艺简单、对环境无污染、可规模化工业生产、提取率高、蛋白酶的纯度好的优点。2.本专利技术涉及一种对未成熟的青皮木瓜萃取获取木瓜乳汁粗提酶，使用由(NH4)2SO4、PEG400、[N1111]Br组成的四元双水相体系进一萃取木瓜乳汁粗提酶，经超滤后获得高品质木瓜蛋白酶产品的方法，使用该方法可以获得较高的产品纯度和回收率，适合工业推广应用。具体实施方式一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：新鲜生木瓜(摘自海南大学农业基地番木瓜树)；[N1111]Br纯度高于99％，兰州雨陆精细化工有限公司；硫酸铵(AR)、PEG400(CP)国药集团化学试剂有限公司；Alpha1-2LDplus冷冻干燥机，五洲东方科技发展有限公司。溶液配制：1)分别称取0.2mmolEDTA(乙二胺四乙酸)，1mmolNaCl，0.04mol半胱氨酸盐酸盐至于烧杯中，加入纯净水至1L，配制含有0.2mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、1mmol/LNaCl和0.04mol/L半胱氨酸盐酸盐的溶液备用。2)先制备60wt％PEG400原溶液、40wt％(NH4)2SO4原溶液，5wt％的[N1111]Br原溶液。3)再分别分别称量一定质量的PEG400原溶液、(NH4)2SO4原溶液、[N1111]Br原溶液及蒸馏水，按照(NH4)2SO4浓度为18wt％，PEG400浓度为18wt％，[N1111]Br浓度为3wt％和(NH4)2SO4浓度为25wt％，PEG400浓度为25wt％，[N1111]Br浓度为5wt％和(NH4)2SO4浓度为20.20wt％，PEG400浓度为20.25wt％，[N1111]Br浓度为4wt％三种不同浓度的四元双水相体系。实施例1将新鲜生木瓜经几次纵切处理后，加入到破碎机中收集乳汁及果渣，按1：1的比例加入500ml含有0.2mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、1mmol/LNaCl和0.04mol/L半胱氨酸盐酸盐的溶液中，将混合液经4层纱布过滤后，4℃5000g离心30min，得粗酶液，经冷冻干燥得木瓜乳汁粗提酶。将5g木瓜乳汁粗提酶与50ml(NH4)2SO4浓度为18wt％，PEG400浓度为18wt％，[N1111]Br浓度为3wt％四元双水相体系加入到100ml烧杯中，加入微量硫酸调节PH值为6，在50℃水浴锅中进行搅拌萃取，搅拌30分钟后，静止1小时，分离上层溶液，使用可滤过10000Da的超滤机对上相萃取液进行超滤，使用冷冻干燥机对超滤后的滤液进行冷冻、干燥处理，既得成品的木瓜蛋白酶。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)将未成熟的青皮木瓜进行破碎处理，将破碎后的木瓜加入到由乙二胺四乙酸、氯化钠和半胱氨酸盐酸盐组成的溶液中进行充分混合；/n(2)将混合液中不溶的皮渣过滤掉，将过滤后得到的滤液在3-10℃环境下经离心、冷冻干燥后得到木瓜乳汁粗提酶；/n(3)将木瓜乳汁粗提酶加入到由成相剂、萃取辅助剂组成的四元双水相体系中，经充分混合后，静止待形成明显的上下相，含酶的萃取液位于上相，回收上相，对上相萃取液进行超滤处理；/n(4)对超滤后的液体进行浓缩处理；浓缩液经冷冻干燥后，获得纯净的木瓜蛋白酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将未成熟的青皮木瓜进行破碎处理，将破碎后的木瓜加入到由乙二胺四乙酸、氯化钠和半胱氨酸盐酸盐组成的溶液中进行充分混合；
(2)将混合液中不溶的皮渣过滤掉，将过滤后得到的滤液在3-10℃环境下经离心、冷冻干燥后得到木瓜乳汁粗提酶；
(3)将木瓜乳汁粗提酶加入到由成相剂、萃取辅助剂组成的四元双水相体系中，经充分混合后，静止待形成明显的上下相，含酶的萃取液位于上相，回收上相，对上相萃取液进行超滤处理；
(4)对超滤后的液体进行浓缩处理；浓缩液经冷冻干燥后，获得纯净的木瓜蛋白酶。


2.根据权利要求1所述制备木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，乙二胺四乙酸浓度为0.2mmol/L，氯化钠浓度为1mmol/L，半胱氨酸盐酸盐浓度为0.04mol/L。


3.根据权利要求1所述制备木瓜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，(NH4)2SO4、PEG400作为成相剂，[N...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉惜，
申请(专利权)人：海南南国健康产业有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46