用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节对于一系列医学病症诸如黄斑变性如年龄相关的黄斑变性有益。

Antisense oligonucleotide for regulating HtrA1 expression

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸专利
本专利技术涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节对于一系列医学病症诸如黄斑变性如年龄相关的黄斑变性有益。
技术介绍
人高温需求A(humanhightemperaturerequirementA，HTRA)家族的丝氨酸蛋白酶普遍表达的PDZ蛋白酶，其通过蛋白酶和分子伴侣的双重功能，参与维持细胞外区室的蛋白质稳态。HTRA蛋白酶与细胞外基质的组织，细胞增殖和衰老有关。HTRA活性的调节与严重疾病有关，所述严重疾病包括迪谢内肌营养不良(Bakay等2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)，关节炎(诸如骨关节炎(Grau等2006，JBC281：6124-6129)，癌症，家族性缺血性脑小血管疾病和年龄相关的黄斑变性，以及帕金森病和阿尔茨海默病。人HTRA1含有胰岛素样生长因子(IGF)结合结构域。已经提出其调节IGF的可用性和细胞生长(Zumbrunn和Trueb，1996，FEESLetters398：189-192)并展现出肿瘤抑制特性。HTRA1表达在转移性黑色素瘤中下调，并因此可能指示黑色素瘤的进展程度。转移性黑素瘤细胞系中HTRA1的过表达减少了体外增殖和侵袭，并且在异种移植小鼠模型中减少了肿瘤的生长(Baldi等，2002，Oncogene21：6684-6688)。在卵巢癌中，HTRA1表达也下调。在卵巢癌细胞系中，HTRA1过度表达诱导细胞死亡，而反义HTRA1表达促进锚定非依赖性生长(Chien等，2004，Oncogene23：1636-1644)。除了对IGF途径的作用外，HTRA1还抑制TGFβ家族生长因子的信号传导(Oka等，2004，Development131：1041-1053)。HTRA1能够切割淀粉样前体蛋白(APP)，HTRA1抑制剂引起Aβ肽在培养细胞中的积累。因此，HTRA1也与阿尔茨海默病有关(Grau等，2005，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.102：6021-6026)。此外，已经观察到HTRA1上调并且似乎与迪谢内肌营养不良(Bakay等2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)和骨关节炎(Grau等2006，JBC281：6124-6129)和AMD(Fritsche，等NatGen201345(4)：433-9)有关。HTRA1启动子区域(rs11200638)中的单核苷酸多态性(SNP)与发生年龄相关的黄斑变性(AMD)的风险增加了10倍有关。此外，HTRA1SNP与发展年龄相关的黄斑变性(AMD)的风险增加有关的ARMS2SNP(rs10490924)存在连锁不平衡。风险等位基因与HTRA1mRNA和蛋白质表达增加2-3倍相关，并且HTRA在AMD患者的玻璃疣中存在(Dewan等，2006，Science314：989-992；Yang等，2006，Science314：992-993)。HtrA1的过表达在小鼠中诱导AMD样表型。hHTRA转基因小鼠(Veierkottn，PlosOne2011)揭示了Bruch膜弹性层的降解，确定脉络膜血管异常(Jones，PNAS，2011年)，并增加了息肉状脉络膜血管病变(Polypoidalchoroidalvasculopathy，PCV)病变(Kumar，IOVS2014)。此外，已报道hHTRA1Tg小鼠中的Bruch膜损伤，这决定了其暴露于香烟烟雾后增加CNV3倍(Nakayama，IOVS2014)。年龄相关的黄斑变性(AMD)是65岁以上人群不可逆视力丧失的主要原因。随着AMD的发作，眼后部的光敏感光感受器细胞，在代谢上支持他们的下层色素上皮细胞以及他们提供的清晰的中央视觉逐渐丧失。年龄是AMD发病的主要危险因素：55岁后患AMD的可能性增至三倍。吸烟，浅的虹膜颜色，性别(女性风险更大)，肥胖以及反复暴露于UV辐射也会增加患AMD的风险。AMD进展可分为三个阶段：1)早期AMD，2)中期AMD和3)晚期AMD。晚期AMD有两种形式：干性AMD(也称为地图状萎缩，GA)和湿性AMD(也称为渗出性AMD)。干性AMD的特征在于光感受器和视网膜色素上皮细胞的丧失，其导致视觉丧失。湿性AMD与病理性脉络膜的(也称为视网膜下的)新血管形成有关。在此过程中形成的异常血管的泄漏会破坏黄斑并损伤视力，最终导致失明。在某些情况下，患者可以表现出与两种类型的晚期AMD相关的病理。湿性AMD的治疗策略需要经常注射到眼睛中，并且主要集中在延迟疾病的进展上。目前尚无用于干性AMD的治疗方法。因此，在提供治疗黄斑变性病况例如湿性和干性AMD的有效药物方面存在未满足的医学需求。WO2008/013893要求保护用于治疗患有年龄相关的黄斑变性的受试者的组合物，其包含核酸分子，所述核酸分子包含与HTRA1基因或mRNA杂交的反义序列：没有公开反义分子。WO2009/006460提供靶向HTRA1的siRNA及其在治疗AMD中的用途。专利技术目的本专利技术提供体内或体外调节HTRA1的反义寡核苷酸。本专利技术鉴定了存在于人HTRA1mRNA(包括前mRNA)中的隐蔽靶序列基序，其可以被反义寡核苷酸靶向以产生有效的HTRA1抑制。本专利技术还提供能够抑制HTRA1的有效的反义寡核苷酸序列和化合物，以及它们在治疗指示HTRA1的疾病或病症中的用途。
技术实现思路
本专利技术涉及靶向哺乳动物HTRA1核酸的寡核苷酸，即是能够抑制HTRA1的表达并治疗或预防与HTRA1的功能有关的疾病的。靶向HTRA1的寡核苷酸是反义寡核苷酸，即是与其HTRA1核酸靶标互补的。本专利技术的寡核苷酸可以是药学上可接受的盐的形式，例如钠盐或钾盐。因此，本专利技术提供反义寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸的，具有与哺乳动物HTRA1核酸的至少90％的互补性的(诸如完全互补的)连续核苷酸序列，诸如SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3或SEQIDNO4。在另一方面，本专利技术提供包含本专利技术的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂的药物组合物。本专利技术提供LNA反义寡核苷酸，诸如LNAgapmer寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸的，具有与HTRA1核酸至少90％的互补性的(诸如完全互补的)连续核苷酸序列，诸如选自由SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3或SEQIDNO4组成的组的序列。本专利技术提供一种反义寡核苷酸，其包含在10-30个(诸如12至22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQIDNO113至少90％互补，诸如100％互补。本专利技术提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少90％(诸如100％)互补：SEQIDNO113：SEQIDNO113的反向互补序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸靶向HTRA1核酸，并包含10-22个核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 113至少有90％诸如100％的互补性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170601 EP 17173964.2;20171221 EP 17209407.0;20171.长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸靶向HTRA1核酸，并包含10-22个核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与SEQIDNO113至少有90％诸如100％的互补性。


2.权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述连续的核苷酸区域与选自由SEQIDNo231，186，192和205组成的组的序列完全互补。


3.权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与选自由SEQIDNO124-230组成的组的序列完全互补的至少12个连续核苷酸。


4.权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与SEQIDNO113完全互补的至少12个连续核苷酸。


5.权利要求1-4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与SEQIDNO113完全互补的至少14个连续核苷酸。


6.权利要求1-5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域由下述序列组成或包含下述序列：选自SEQIDNO67，73和86中的任一个，或其至少12个连续核苷酸。


7.权利要求1-6中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含一个或更多个2’糖修饰的核苷，诸如独立地选自由以下各项组成的组的一个或更多个2’糖修饰的核苷：2’-O-烷基-RNA，2’-O-甲基-RNA，2’-烷氧基-RNA，2’-O-甲氧基乙基-RNA，2’-氨基-DNA，2’-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(ANA)，2’-氟-ANA和LNA核苷。


8.权利要求1-7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含至少一个经修饰的核苷间连接，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间连接，或诸如所述连续核苷酸区域内的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。


9.权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列是或包含gapmer，诸如式5’-F-G-F’-3’的gapmer，其中区域F和F’独立地包含1-7个糖修饰的核苷，且G是能够募集RNA酶H的6-16个核苷的区域，其中与区域G相邻的区域F和F’的核苷是糖修饰的核苷。


10.权利要求9所述的反义寡核苷酸，其中，区域F和F’中的至少一个或两者各自包含至少一个LNA核苷。


11.权利要求1-10中任一项的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域选自以下各项的组：
TTCtatctacgcaTTG(SEQIDNO67)，
CTTCttctatctacgcAT(SEQIDNO73)，和
TACTttaatagcTCAA(SEQIDNO86)；
其中大写字母是LNA核苷酸，小写字母...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁文·阿尔瓦雷斯·桑切斯，罗伯托·依阿哥尼，彼得·哈哲多恩，苏珊娜·凯姆乐，索仁·奥托森，辛德瑞·特劳斯塔森，海迪·赖伊·胡德布施，吕克·彼泽森，马尔科·贝雷拉，安德雷斯·迪克曼，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH