用于提高基因组编辑效率的化合物制造技术

本发明专利技术涉及适于提高在真核靶细胞或靶生物体中的精确基因组编辑效率的化合物、组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提高基因组编辑效率的化合物
本专利技术涉及适合于提高在真核靶细胞或靶生物体中的精确基因组编辑效率的化合物、组合物和试剂盒。
技术介绍
CRISPR是对抗病毒DNA的细菌核酸酶免疫系统，其已经被采用用来准确地切割真核细胞中的染色体DNA序列。这样的DNA断裂需要通过两个竞争通路来修复：非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在NHEJ中，结合DNA末端的第一个蛋白是Ku70/Ku80，接着是DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)(Shrivastav等人，2008)。该激酶磷酸化自身以及修复位点处的其他下游效应器。几种蛋白质如Artemis的征集和磷酸化通过连接酶IV(LIG4)、X-射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)和非同源末端连接因子1(XLF)产生末端加工连接(Dueva,Iliakis2013)。如果此典型的NHEJ通路被遏制，则备选的NHEJ通路(A-NHEJ)变得有活性(Nussenzweig,Nussenzweig2007)。除其他蛋白之外，其需要多聚(ADP-核糖)-聚合酶1(PARP-1)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.下列各项用于在真核靶细胞，特别是哺乳动物靶细胞中的基因组编辑的用途：/n(i)DNA蛋白激酶催化亚基，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整，并且与野生型序列相比包含至少一个突变，/n(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子，和/或/n(iii)包含或能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的真核细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170410 EP 17165784.4;20171124 EP 17203591.71.下列各项用于在真核靶细胞，特别是哺乳动物靶细胞中的基因组编辑的用途：
(i)DNA蛋白激酶催化亚基，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整，并且与野生型序列相比包含至少一个突变，
(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子，和/或
(iii)包含或能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的真核细胞。


2.权利要求1所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含基于人NCBI参考序列NP_008835.5的催化环(氨基酸3917-3927)、P-环(氨基酸3729-3735)或邻近区域(氨基酸3736-3760)中的至少一个突变，所述突变包括导致截短的突变(例如，Y4046*)，所述导致截短的突变使所述激酶活性减少或失活，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。


3.权利要求1或2所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含基于人NCBI参考序列NP_008835.5的位置K3753、位置D3922、位置T3950和/或位置F3946处的至少一个突变，其中氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。


4.权利要求3所述的用途，其中所述突变在位置K3753处，特别是在K3753R处，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。


5.权利要求1所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含磷酸化簇中的至少一个突变，所述突变正常地是其自身磷酸化功能的靶标，包括失活突变，例如但不限于用于PQR簇(S2023和/或S2029和/或S2041和/或S2053和/或S2056)的丙氨酸，和/或激活(模拟磷酸化)突变，例如但不限于用于ABCDE簇(T2069和/或S2612和/或T2620和/或S2624和/或T2638和/或T2647)和/或N簇(S56和/或S72)和/或JK簇(T946和/或S1003)的天冬氨酸，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。


6.权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是真核靶细胞，包括脊椎动物靶细胞。


7.权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是哺乳动物靶细胞，包括啮齿类动物靶细胞或人靶细胞。


8.权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是干细胞，所述干细胞包括真核靶生物体的诱导性多能干细胞或胚胎多能干细胞，特别是人诱导性多能干细胞或人胚胎多能干细胞。


9.权利要求1-8中任一项所述的用途，进一步包括将
(a)为HDAC抑制剂的化合物(I)，
(b)为NAE抑制剂的化合物(II)，
(c)为DNA-PK抑制剂的化合物(III)，或
(d)为RPA抑制剂的化合物(IV)
或所述化合物中的至少2种、至少3种或4种的组合引入至所述靶细胞中。


10.权利要求1-9中任一项所述的用途，其中
所述化合物(I)是曲古抑菌素A，和/或
所述化合物(II)是MLN4924，和/或
所述化合物(III)是NU7026和/或
所述化合物(IV)是NSC15520。


11.权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将交错切口,特别是具有5’突出端的交错切口，或平端切口引入至所述靶细胞的双链基因组中。


12.权利要求1-11中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括在所述靶细胞中存在DNA裂解酶，例如(i)存在CRISPR/Cas9D10A酶，或(ii)存在CRISPR/Cpf1酶，或(iii)存在Cas9核酸酶。


13.权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将携带所需要的突变的供体DNA分子引入至所述靶细胞中，所述供体DNA分子是单链或双链DNA分子，特别是单链DNA分子。


14.权利要求1-13中任一项与敲低靶细胞中的内源性DNA-PKcs组合的用途。

【专利技术属性】
技术研发人员：S·里森伯格，T·马里契克，
申请(专利权)人：马克斯·普朗克科学促进学会，
类型：发明
国别省市：德国;DE