一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌制造技术

本发明专利技术本发明专利技术涉及一种产5‑甲基吡嗪‑2羧酸的重组大肠杆菌，具体涉及调节二甲苯单加氧酶双亚基比例提高5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法。所述调节二甲苯单加氧酶双亚基比例是指以大肠杆菌（

A recombinant Escherichia coli producing 5-methylpyrazine-2 carboxylic acid

【技术实现步骤摘要】
一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌
本专利技术涉及一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，还涉及调节二甲苯单加氧酶双亚基比例提高5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，属于遗传工程

技术介绍
5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylicacid，MPCA）是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。目前其合成主要采用化学合成法，可分为分子间环合法、吡嗪侧链多步合成法、直接氧化法和电化学法。但化学合成法存在反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大的问题。生物转化法则具有合成工艺简单，底物选择性好，催化效率高，杂质少，对环境污染小的优点，极具发展前景。国内浙江工业大学（郑裕国等,化学与生物工程,2012,29(9):19~25）筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌，并利用该菌株进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制备，经过补料发酵产率可达到75.6%，产物浓度达到20.41g/L，周期达到了22天。专利CN106本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，将恶臭假单胞杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，将恶臭假单胞杆菌（pseudomonasputida）ATCC33015中二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，同时调节二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1～3:3，从而构建不同的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌。


2.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的二甲苯单加氧酶基因如NCBI上GeneID:1218754和GeneID:1218743，苯甲醇脱氢酶基因如GeneID:9121238所示，苯甲醛脱氢酶基因如GeneID:1218745所示。


3.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合flhD位点。


4.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶终端羟化酶基因（xylM）、电子传递蛋白基因（xylA）和二甲苯单加氧酶基因（xylM-xylA）整合至motA、cheW、cheY位点。


5.根据权利要求1-4任一所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。


6.权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1构建产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌：
先构建二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合框，通过同源重组将整合框代替大肠杆菌（EscherichiacoliBL21(DE3)）基因组中鞭毛区基因flhD，得到产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌E.coliMPCA1，其中；x...

【专利技术属性】
技术研发人员：李广生，杨涛，王祥法，门晋名，曲欣欣，王晓群，李庆猛，
申请(专利权)人：迪嘉药业集团有限公司，迪沙药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37