一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种胞内外分泌4‑α‑糖基转移酶(4GT)的基因工程菌(重组大肠杆菌)，属于酶基因工程和酶工程领域。所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET‑32a(+)导入到宿主细胞大肠杆菌中得到。本发明专利技术构建的基因工程菌株的胞外4GT酶活可达到167.47U/mL。该重组酶的最适温度为60℃，最适pH为7.0，所述4GT具有转苷活性，能使淀粉中支链淀粉的侧链长度延长，适合食品、化妆品和医药等工业应用的需要，能用于高支化淀粉的工业生产。本发明专利技术的优点在于以大肠杆菌为宿主，4GT不仅在其胞内进行了表达，而且在其胞外也能高效表达，这不仅减少了杂蛋白对4GT酶活及4GT纯化时的干扰，也可简化生产4GT的流程。

A genetically engineered strain secreting 4-\u03b1-glycosyltransferase and its fermentation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用
本专利技术属于酶基因工程和酶工程领域，涉及一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用。
技术介绍
来自嗜热栖热菌HB8(ThermusthermophilusHB8，ATTC27634)的4-α-糖基转移酶(4-α-glycosyltransferase，简称4GT，EC2.4.1.25)作用于淀粉，可断裂其α-1,4糖苷键，形成新的α-1,4糖苷键，致直链淀粉或支链淀粉的主链被分解，而支链淀粉的侧链长度将延长。与普通淀粉相比，这种被4GT改性过的淀粉，其回生特性改善，抗消化性提高，溶解性也增加，并且具有热可逆凝胶特性。这些性质提示4GT在食品、化妆品和医药等领域有较大的应用前景。目前应用的4GT主要来源于细菌，已发现嗜热放线菌，牛链球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、栖热水生菌、海栖热袍菌、超嗜热古菌和嗜热栖热菌等多种细菌可产4GT。其中，源自嗜热栖热菌HB8的耐热4-α-糖基转移酶制剂4GT由于拥有催化效率高、酶促反应温度高，热稳定性好、底物范围广等独特优势，使得该菌在发酵工业上有着良好的应用前景。其中开发并应用嗜热酶成为国内外研究的焦点。由于原有微生物体内4GT含量普遍较低，且提取困难，故实际生产应用中比较重视开发4GT基因工程菌。大肠杆菌由于拥有遗传背景清楚、繁殖快和成本低等优点，是发展最早和应用最广泛的经典表达系统。4GT蛋白在大肠杆菌中是以胞内可溶性的形式表达，在利用大肠杆菌生产4GT蛋白时，需要对细胞进行破壁处理才能获得，不利于重组4GT的回收和使用。且4GT酶活普遍较低，胞内4GT纯化困难，这些均限制了其工业化应用。因此，实现4GT在大肠杆菌中的胞外分泌，简化制备4GT的流程，减少杂蛋白对4GT活性的影响对于工业化应用具有重要影响；通过优化其重组菌的发酵条件，如培养基成分、培养基pH、培养温度、接种量、装液量、诱导时间和IPTG浓度，以期提高4GT重组蛋白的胞外分泌，对推动4GT的工业化应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的上述缺陷，提供了一种4-α-糖基转移酶的克隆与高效表达方法。本专利技术提出了一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌(重组大肠杆菌)，通过将来源于嗜热栖热菌HB8(ThermusthermophilusHB8)的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到。所述基因工程菌能够在胞内外高效分泌4GT。其中，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。由已有报道可知，4GT在大肠杆菌克隆菌株中的表达几乎全部为胞内表达。而本专利技术中的4GT，在无外在信号肽的介导下，不仅在其胞内成功表达，且能以有活性的形式分泌至胞外，且在胞外进行高效表达。而这种胞外分泌4GT的形式，不仅减少了胞内杂蛋白对4GT酶活的干扰，也简化了生产4GT的流程。本专利技术还提供了一种构建分泌表达4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)的方法，将来源于嗜热栖热菌HB8(ThermusthermophilusHB8)的编码4GT基因导入质粒pET-32a(+)中，构建得到pET32a-4GT，然后转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择培养基挑选得到包含该质粒的基因工程菌；具体包括以下步骤：1)扩增SEQIDNO.1所示的目的基因，连接到质粒pET-32a(+)上，转化至感受态的大肠杆菌DH5α，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获取重组质粒pET32a-4GT；2)将重组质粒pET32a-4GT通过CaCl2转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pET32a-4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。步骤1)中，所述大肠杆菌还可以为TOP10。步骤1)或2)中，所述固体培养基为LB、TB、SOB和SOC固体培养基等；优选地，为LB。其中，所述LB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。其中，TB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH2PO4：2.2g/L：K2HPO4：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。其中，SOB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl2：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。其中，SOC固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl2：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。步骤2)中，所述CaCl2转化法可参考肖庚福《一种快速简便的CaCl2质粒转化方法》中所述方法。步骤2)中，所述转化的方法还可以为电转法，可参考朱森康《制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究》中的方法。本专利技术还提供了一种按如上所述方法构建得到的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。该基因工程菌是将4-α-糖基转移酶基因通过质粒pET-32a(+)导入到宿主细胞，其可将产生的4-α-糖基转移酶留在细胞内，也可将4-α-糖基转移酶在胞外进行高效分泌表达。其碱基序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种利用所述的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)生产4GT的方法，包括如下步骤：1)菌株的活化：将基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)接种至2mL-3mL的种子培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养9h-12h。2)粗酶液的制备：将步骤1)活化好的种子培养液接种至发酵培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养菌液OD600值为0.4-0.6时，加0.2mM-1.5mMIPTG继续诱导表达9h-12h，停止发酵，离心，收集上清，弃沉淀，获得4-α-糖基转移酶的粗酶液。其中，所述沉淀用超声破碎仪进行破碎获得粗酶液，最终得到上清与沉淀中的粗酶液。步骤(1)中，所述种子培养液为LB液体培养基，其组成及含量为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min，以备用。本专利技术还提供了一种大肠杆菌中高效分泌表达4GT的生产方法，包括如下发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到；所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。/n

【技术特征摘要】
1.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到；所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT基因导入质粒pET-32a(+)中，构建得到pET32a-4GT，然后转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择培养基挑选得到包含该质粒的基因工程菌。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1)扩增SEQIDNO.1所示的目的基因，连接到质粒pET-32a(+)上，转化至感受态的大肠杆菌DH5α，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获取重组质粒pET32a-4GT；
2)将步骤(1)所述的重组质粒pET32a-4GT通过CaCl2转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pET32a-4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为LB、TB、SOB和SOC；
其中，所述LB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨/胰酪胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min；
其中，所述TB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH2PO4：2.2g/L：K2HPO4：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；
其中，所述SOB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl2：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；
其中，所述SOC固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl2：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。


6.根据权利要求3-5之任一项方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄静，欧阳小英，万惠惠，施瑞，杨婷，朱锐，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31