【技术实现步骤摘要】
生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法
本专利技术涉及一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法，属于工业微生物领域。
技术介绍
纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量较丰富的可再生性资源之一。随着石油和煤炭等化石资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布广泛、丰富和廉价的可再生性有机资源是制约纤维素和生物质利用的一个关键问题。利用纤维素或生物质进行生物炼制，首先要将其转化为水溶性小分子寡糖和单糖，才能进一步发酵供微生物产生物乙醇或生物柴油。利用生物酶法将纤维素转化为可溶性的寡糖或单糖具有条件温和，转化效率高和有毒副产物少等优点，在生物质转化、造纸和环境治理过程中得到广泛应用。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素生产寡糖和葡萄糖。纤维素酶主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖...
【技术保护点】
1.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中。/n
【技术特征摘要】
1.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中。
2.根据权利要求1所述的生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：CBHⅡ基因整合过程采用的载体为表达载体PSNCⅡ，序列见SEQIDNO:14。
3.根据权利要求1所述的生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述表达载体PSNCⅡ的构建方法如下：
(1)以序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为上下游引物，以Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌为模板；以序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂序列downstream；获得序列如序列表中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11所示；(2)对步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up进行ApaI酶切处理，对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PStI和BamHI双酶切，对步骤(1)中所获得的下游臂序列downstream进行SacI与SacⅡ双酶切；(3)将pBluescriptSK质粒进行进行PStI和BamHI双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacI与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接,得到质粒P5ST1T2-downstream；(4)用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列表中SEQIDNO:12所示；(5)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(4)所获得的Kana序列在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得质粒载体P5ST1T2npt；(6)用限制性内切酶ApaI处理质粒P5ST1T2npt，将所回收获得的Promoter-up片段和纤维素外切酶CBHⅡ基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSNCⅡ。
4.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)质粒构建以质粒P5ST1T2-downstream为基础(序列如SEQIDNO:14所示)，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂Promoter-up，通过引物在Promoter-up两端...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴玉杰，宁玉林，邵强，孟庆营，赵潇潇，陈高，吕和鑫，贾士儒，钟成，谭之磊，
申请(专利权)人：天津科技大学，山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：天津;12
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