生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法，属于工业微生物领域。本发明专利技术通过同源重组的方法将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中得到一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803藻株SPSNCⅡ。在相同培养条件下所产生的纤维素酶活性明显优于野生集胞藻藻株。本发明专利技术开辟了一种通过光合生物‑集胞藻，利用无机盐和二氧化碳来获得纤维素酶的新途径，对于降低酶生产过程中的有机碳源消耗，减少纤维素酶生产过程中的温室气体排放具有重要的意义和广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法
本专利技术涉及一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法，属于工业微生物领域。
技术介绍
纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量较丰富的可再生性资源之一。随着石油和煤炭等化石资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布广泛、丰富和廉价的可再生性有机资源是制约纤维素和生物质利用的一个关键问题。利用纤维素或生物质进行生物炼制，首先要将其转化为水溶性小分子寡糖和单糖，才能进一步发酵供微生物产生物乙醇或生物柴油。利用生物酶法将纤维素转化为可溶性的寡糖或单糖具有条件温和，转化效率高和有毒副产物少等优点，在生物质转化、造纸和环境治理过程中得到广泛应用。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素生产寡糖和葡萄糖。纤维素酶主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。内切β-葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖生产两分子的葡萄糖。纤维素酶在工、农、畜和医学等领域都有广泛的应用，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。目前，虽然产生纤维素酶的生物种类很多，如霉菌、细菌、真菌、放线菌等。如在工业上应用较广的有木霉属(Trichoderma)的几个种如粉状侧孢(Sporitrichumpalverulentum)，腐皮镰孢(Fusariumsolani)，绳状青霉(Pencilliumfuniculosum)等霉菌和木腐菌菌株上，尤其是里氏木霉(T.reesei)研究的最多。生产方法多采用固体发酵法生产，但是，这些产酶方法都是以异养微生物利用有机碳源如麸皮、玉米杆、稻草等有机碳源为原料进行生产，在酶生产过程中消耗了大量有机碳源，这就使得生物质转化为生物能源过程效率以及碳的利用率很低，从能量转化角度是不利的，严重限制了利用生物质进行生物能源转化的效率和可行性。如能通过改造光合生物，依靠光合作用，利用二氧化碳和简单无机盐为主的培养基来产纤维素酶，就可以减少纤维素酶生产过程中的碳源和能源消耗，提高生物质转化的效率，不仅可以降低生物质转化过程的能源和碳源消耗，而且还可以实现对温室气体的有效利用。蓝藻是一类能进行植物型产氧光合作用的原核生物，集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)是一种具有自然转化系统的单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不生产毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，它能利用光能进行自养生长，是光合作用分子生物学研究的重要模式生物之一。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化，不需要有机碳源，藻细胞培养成本低等的优点，因此，近年来利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产脂肪酸、药物等高附加值产品成为研究的热点。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术目的在于提供一种可产纤维素纤维素外切酶CBHⅡ的集胞藻PCC6803藻株，该藻株可依靠光合作用，利用无机盐和二氧化碳生产纤维素酶。本专利技术还提供一种可产纤维素外切酶CBHⅡ的集胞藻基因工程藻株的构建方法。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中，获得一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSNCⅡ。而且，CBHⅡ基因整合过程采用的载体为表达载体PSNCⅡ。而且，所述表达载体PSNCⅡ的构建方法如下：(1)以序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为上下游引物，以Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌为模板；以序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂序列downstream；获得序列如序列表中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11所示；(2)对步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up进行ApaI酶切处理；对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PStI和BamHI双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂序列downstream进行SacI与SacⅡ双酶切；(3)将pBluescriptSK质粒进行PStI和BamHI双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacI与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接,得到质粒P5ST1T2-downstream；(4)用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列表中SEQIDNO:12所示；(5)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(4)所获得的Kana序列在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得质粒载体P5ST1T2npt；(6)用限制性内切酶ApaI处理质粒P5ST1T2npt，将所回收获得的Promoter-up片段和纤维素外切酶CBHⅡ基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSNCⅡ。一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，包括如下步骤：(1)质粒构建以质粒P5ST1T2-downstream为基础(序列如SEQIDNO:14所示),以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂Promoter-up，通过引物在Promoter-up两端+添加酶切位点ApaI,获得序列如SEQIDNO：9所示；(2)以序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:8为上下游引物，以GenBank数据库中里氏木霉TrichodermareeseiQM9414的相应基因序列为模板,通过PCR扩增技术获得纤维素外切酶CBHⅡ基因片段，序列如SEQIDNO:13所示；(3)用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列SEQIDNO:12所示；(4)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream；将步骤(3)所获得的Kana序列在T4连接酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：将外源纤维素外切酶CBHⅡ基因整合至集胞藻PCC6803基因组中。


2.根据权利要求1所述的生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：CBHⅡ基因整合过程采用的载体为表达载体PSNCⅡ，序列见SEQIDNO:14。


3.根据权利要求1所述的生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述表达载体PSNCⅡ的构建方法如下：
(1)以序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为上下游引物，以Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌为模板；以序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂序列downstream；获得序列如序列表中SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11所示；(2)对步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因序列Promoter-up进行ApaI酶切处理，对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PStI和BamHI双酶切，对步骤(1)中所获得的下游臂序列downstream进行SacI与SacⅡ双酶切；(3)将pBluescriptSK质粒进行进行PStI和BamHI双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacI与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接,得到质粒P5ST1T2-downstream；(4)用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列表中SEQIDNO:12所示；(5)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(4)所获得的Kana序列在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得质粒载体P5ST1T2npt；(6)用限制性内切酶ApaI处理质粒P5ST1T2npt，将所回收获得的Promoter-up片段和纤维素外切酶CBHⅡ基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSNCⅡ。


4.一种生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)质粒构建以质粒P5ST1T2-downstream为基础(序列如SEQIDNO:14所示)，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂Promoter-up，通过引物在Promoter-up两端...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴玉杰，宁玉林，邵强，孟庆营，赵潇潇，陈高，吕和鑫，贾士儒，钟成，谭之磊，
申请(专利权)人：天津科技大学，山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：天津;12