一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微生物制备3

【技术实现步骤摘要】
一种3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种利用微生物制备3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的方法，属于生物化工


技术介绍

[0002]3‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸是一种用途广泛的化工产品，许多重要的有机产品均是以它为原料获得的，如4
‑
氯喹唑啉
‑6‑
甲酸乙酯、2
‑
正丙基
‑4‑
甲基
‑6‑
羧基苯并咪唑、4
‑
甲基
‑2‑
乙基
‑
1H
‑
苯并咪唑
‑6‑
甲酸甲酯、3,4
‑
二氢
‑4‑
喹唑啉酮
‑6‑
甲酸、4
‑
氨基苯基
‑
1,3
‑
二甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
甲基苯甲酸甲酯、4
‑
硝基苯基
‑
1,3
‑
二甲酸等；另外3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸还用于医药，是合成抗高血压药物替米沙坦、艾滋病药物的重要中间体。
[0003]合成3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的方法主要有空气氧化法、醋酸钴催化氧化法、重铬酸钾氧化法、硝酸氧化法等，收率约30％
‑
86％。《应用化学》2005年第12期岳彩波、魏运洋等在《催化分子氧氧化合成3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸》一文中以分子氧作为氧化剂，在醋酸钴催化剂体系(醋酸钴/丁酮/乙酸)中加入助催化剂溴化钠，3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的收率为51%；中国专利 CN200610107316.6《一种催化剂及其在合成4
‑
硝基
‑3‑
甲基苯甲酸反应中的应用中》一文中以过渡金属氧化物和一种N上有溴或者羟基取代的含N有机化合物组成的催化剂，在溶剂条件下催化氧化2,4
‑
二甲基硝基苯合成3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸，收率为51%。中国专利CN103319347A《阶梯式加热法与间接电合成3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的方法》首先将硫酸铬电解氧化为三氧化铬，在用三氧化铬将2,4
‑
二甲基硝基苯氧化成3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸；通过采用阶梯式加热法，转化率达到了65%
‑
86%，但其催化剂、氧化剂价格昂贵，催化剂回收等后处理难度大，生产费用及环保处理费用较高；硝酸氧化法氧化性较强，容易氧化产生双硝基的产物，但硝化过程存在较高的安全隐患，并且硝酸对环境污染严重。
[0004]目前报道的3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸的生产方法均为化学法进行合成，未见微生物催化工艺的报道。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：提供一种适合工业化生产的微生物法制备3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸工艺。
[0006]实验中发现，用于生产5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的重组大肠杆菌菌株（该菌株重组了来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 33015的二甲苯单加氧酶XMO编码基因xylMA、苯甲醇脱氢酶BADH编码基因xylB和苯甲醛脱氢酶BZDHH编码基因xylC）能够以2,4
‑
二甲基硝基苯为底物（式1化合物），以氧气为氧化剂，在一定的条件下催化得到3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸（式4化合物），产品质量收率最高在12%。具体实验过程如下：取表达了二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶的基础重组大肠杆菌工程菌（菌种保藏编号为：CGMCC NO.14930），在LB 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50
‑
1/10原始发酵液体积的pH为8的磷酸盐缓冲液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液。该全细胞酶液以2,4
‑
二甲基硝基苯为底物在一定的条件下进行催化反应，经HPLC
检测，有3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸产物生成。催化反应液经硅藻土过滤后、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取，旋蒸得产物3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸，底物转化率12%，产品含量98.5%，纯度99.8%。其催化过程如下所示：。
[0007]鉴于以上实验转化率低，申请人尝试对上述重组大肠杆菌工程菌进行了改进，获得了本专利技术技术方案，具体如下。
[0008]利用一种基于易错PCR技术的酶体外进化技术，以含有苯甲醇脱氢酶BADH编码基因xylB的重组质粒pRSFDuet
‑1‑
xylB为模板，使用易错PCR技术进行定向进化，经过大量筛选获得酶活单位明显提高的突变株。经检测突变菌株为苯甲醇脱氢酶发生突变，突变的重组菌株能够将底物转化率由12%提高至80%以上。
[0009]本专利技术技术方案为：一种重组大肠杆菌菌株，为 E.coli BL21
‑
pRSFDuet
‑1‑
L163W，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0010]本专利技术所述重组大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：第一步 含改进的苯甲醇脱氢酶编码基因的重组大肠杆菌制备：以含有苯甲醇脱氢酶BADH编码基因xylB的重组质粒pRSFDuet
‑1‑
xylB为模板，使用易错PCR技术进行定向进化。根据《分子克隆实验指南》，具体地为经过PCR反应后，获得含有线性基因片段的PCR产物，将这些PCR产物和pRSFDuet
‑
1表达质粒分别进行双酶切（EcoRI、Not I）、纯化、连接和转化已含有二甲苯单加氧酶XMO编码基因xylMA和苯甲醛脱氢酶BZDHH编码基因xylC的基础大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜。
[0011]第二步 挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养15 h，离心收集菌体进行质粒提取、PCR 鉴定和双酶切鉴定，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达，具体操作为：将上述菌液转接于100 mL含50 μg/ml 硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述重组大肠杆菌菌株为 E.coli BL21
‑
pRSFDuet
‑1‑
L163W，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步 含改进的苯甲醇脱氢酶编码基因的重组大肠杆菌制备：以含有苯甲醇脱氢酶BADH编码基因xylB的重组质粒pRSFDuet
‑1‑
xylB为模板，使用易错PCR技术进行定向进化，将PCR产物和pRSFDuet
‑
1表达质粒分别进行双酶切（EcoRI、Not I）、纯化、连接和转化已含有二甲苯单加氧酶XMO编码基因xylMA和苯甲醛脱氢酶BZDHH编码基因xylC的基础大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜；第二步 挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养15 h，离心收集菌体进行质粒提取、PCR 鉴定和双酶切鉴定，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达，具体操作为：将上述菌液转接于100 mL含50 μg/ml 硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50
‑
1/10原始发酵液体积的pH为8的磷酸盐缓冲液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液，该全细胞酶液用于催化验证试验，得重组大肠杆菌菌株E.coliBL21
‑
pRSFDuet
‑1‑
L163W。3.权利要求2所述重组大肠杆菌菌株E.coliBL21
‑
pRSFDuet
‑1‑
L163W在制备3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯甲酸方面的应用。4.一种制备3
‑
甲基
...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵先祥，夏俊刚，丛日刚，苗华明，翟天龙，门晋名，
申请(专利权)人：迪嘉药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：