一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株高产Xenocoumacin1(Xcn1)的嗜线虫致病杆菌，基于同源重组技术，对嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株中与Xcn1合成代谢相关的基因进行工程改造，获得不产Xcn2、高产Xcn1的菌株，最终获得一株命名为CB6

【技术实现步骤摘要】
一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌菌株及其应用。

技术介绍

[0002]昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括与斯氏线虫属(Steinernema)线虫共生的致病杆菌属(Xenorhabdus)和与异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生的发光杆菌属(Photorhabdus)。共生菌分泌多种酶，降解昆虫组织，释放营养物质，并产生抑菌物质抑制其它杂菌生长，有助于线虫的生长繁殖。共生菌来源于特殊的生境，其代谢物中存在多种具有生物活性的新化合物，目前已分离鉴定的主要有抗菌物质、杀虫蛋白、抗癌物质等。
[0003]研究者前期分离收集到多株昆虫病原线虫共生细菌，通过对不同共生细菌的抑菌活性评价，发现在北京郊区分离到的嗜线虫致病杆菌CB6菌株(CGMCC No.1173，本研究室保存)的代谢产物具有很高的抑菌活性，对马铃薯晚疫病、番茄晚疫病和黄瓜白粉病等多种植物病害具有显著的防治效果。通过对CB6菌株发酵产物中的抗菌成份进行分离纯化和结构鉴定，确定Xenocoumacin1(Xcn1)是拮抗植物病害的主要活性物质。Xcn1是由精氨酸残基、亮氨酸残基和四个乙酸酯单元形成的异香豆素类衍生物，该化合物具有拮抗马铃薯晚疫病、番茄晚疫病、黄瓜白粉病和辣椒疫霉病等植物真菌病害的生物学功能。Xcn1是嗜线虫致病杆菌CB6产生的主要活性物质，但是在菌株代谢过程中，过量积累的Xcn1会激活Xcn1的降解代谢途径，Xcn1会被转化成Xcn2等低活性的衍生物，发酵生产得到的Xcn1随着时间的推进反而产量进一步下降，导致Xcn1无法大量积累。此外，野生型CB6菌株发酵产生Xcn1的水平较低，推测Xcn1合成基因簇中各种酶的表达水平较低是关键限制因素。

技术实现思路

[0004]基于以上技术缺陷，本专利技术的技术目的是提供一株高产Xenocoumacin1(Xcn1)的嗜线虫致病杆菌，基于同源重组技术，对嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株中与Xcn1合成代谢相关的基因进行工程改造，获得不产Xcn2、高产Xcn1的菌株，经技术优化后，最终获得一株命名为CB6
‑
T2的Xcn1产量最高的菌株。经研究发现所述CB6
‑
T2菌株内介导Xcn1降解转化的酶基因xcnM缺失突变，Xcn1合成基因簇的第一个基因xcnA启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter
‑
g3509。
[0005]本专利技术先提供一株嗜线虫致病杆菌，其中所述酶基因xcnM首先以同源重组双交换的方式被缺失突变。具体以大肠杆菌
‑
嗜线虫致病杆菌穿梭克隆载体pJQ200sk为骨架构建基因敲除载体，利用同源重组原理，通过双交换过程获得Xcn1降解途径被阻断，Xcn1高产的菌株。
[0006]在此基础上，进一步本专利技术还发现，在用同源重组基因敲除改造技术将嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株内介导Xcn1转化为Xcn2的酶基因xcnM以同源重组双交换的方式缺失
突变后，再同样采用同源重组双交换方式，将Xcn1合成基因簇的第一个基因xcnA的启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter
‑
g3509，可以获得更好的基因表达效果，Xcn1产量更高的技术效果。经试验发现，通过上述手段最终获得的嗜线虫致病杆菌CB6
‑
T2，在LB培养基中发酵得到的Xcn1产量至少在782mg/L以上，远高于嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株的发酵产量71mg/L。可以有效降低Xcn1产业化开发的生产成本。
[0007]本专利技术还提供所述的高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌的构建方法，优选是采用大肠杆菌
‑
嗜线虫致病杆菌穿梭克隆载体pJQ200sk为骨架构建基因敲除载体，先构建获得xcnM敲除质粒，再将敲除质粒转化到大肠杆菌S17
‑
1λpir中，将大肠杆菌S17
‑
1λpir与嗜线虫致病杆菌共培养进行结合转移，涂布在筛选平板上，获得xcnM敲除阳性克隆。具体方案是先将pJQ200sk质粒线性化、再将pJQ200sk质粒线性化片段、上游同源臂和下游同源臂通过无缝克隆的方式连接在一起，转化到DH5α大肠杆菌感受态中，取100μL涂布含50μg/mL庆大霉素的LB平板上，37℃过夜培养后，获得xcnM敲除阳性克隆质粒。随后将该质粒转化到大肠杆菌S17
‑
1λpir中，将大肠杆菌S17
‑
1λpir与嗜线虫致病杆菌进行接合转移共培养，涂布在筛选平板上，挑取单菌落进行PCR验证，获得xcnM敲除阳性克隆。经试验验证，所述阳性克隆菌株发酵液中只能检测到Xcn1，检测不到Xcn2，说明xcnM基因缺失突变成功，该基因失去活性功能。
[0008]所述的构建方法，进一步还包括构建xcnA启动子敲除替换质粒的步骤，将xcnA启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter
‑
g3509，所述启动子Promoter
‑
g3509的序列如SEQ ID No.15所示。为保证启动子顺利发挥功能，在启动子promoter
‑
g3509序列后面接一段核糖体结合位点RBS序列，如SEQ ID No.16所示。经试验验证，所述启动子Promoter
‑
g3509因来源于嗜线虫致病杆菌自身，表达强度更高，改良后的菌株在发酵培养到48h时Xcn1达到最高水平，Xcn1的含量为782mg/L，在后续的培养过程中，Xcn1的含量依然维持在600mg/L以上。上述结果表明，本专利技术最终获得的改良菌株CB6
‑
T2，可以阻断代谢产物Xcn1的降解并提高Xcn1合成基因簇的转录表达，从而提高了目标代谢产物Xcn1的产量。
附图说明
[0009]图1是HPLC检测嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株与
△
xcnM菌株产Xcn1及其代谢产物情况；
[0010]图2是利用HPLC检测嗜线虫致病杆菌CB6
‑
T2菌株与CB6野生型菌株Xcn1的产量。
具体实施方式
[0011]为进一步说明本专利技术，结合以下实施例具体说明：
[0012]本专利技术涉及的嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)CB6菌株是已知的菌种，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)有所登记和保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株编号CGMCC No.1173。
[0013]本专利技术提供一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌CB6
‑
T2，以CGMCC No.1173嗜线虫致病杆菌CB6为出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌，其特征在于，所述菌株内介导Xcn1降解转化的酶基因xcnM缺失突变。2.根据权利要求1所述的嗜线虫致病杆菌，其特征在于，所述酶基因xcnM以同源重组双交换的方式被缺失突变。3.根据权利要求1或2所述的嗜线虫致病杆菌，其特征在于，所述菌株不产生Xcn2。4.根据权利要求1或2所述的嗜线虫致病杆菌，其特征在于，所述菌株合成Xcn1的基因簇的第一个基因xcnA的启动子被替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter
‑
g3509。5.根据权利要求4所述的嗜线虫致病杆菌，其特征在于，所述菌株在LB培养基发酵培养，得到的Xcn1产量达到782mg/L以上。6.权利要求1所述的高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌的构建方法，其特征在于，采用大肠杆菌
‑
嗜线虫致病杆菌穿梭克隆载体pJQ200sk为骨架构建基因敲除载体，先构建获得xcnM敲除质粒，再将敲除质粒转化到大肠杆菌S17

【专利技术属性】
技术研发人员：李广悦，秦有才，杨秀芬，任杰，曾洪梅，袁京京，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：