一种微生物发酵法生产制备超高分子量透明质酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物发酵法生产制备超高分子量透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术在谷氨酸棒杆菌中游离表达透明质酸合酶编码基因pmhasA，构建了透明质酸的合成途径；采取弱化RBS强度的方法，弱化合酶pmHAS的表达；采取定点突变的策略理性改造透明质酸合成酶编码基因pmhasA；在谷氨酸棒杆菌中通过组合调控策略强化表达前体UDP

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵法生产制备超高分子量透明质酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种微生物发酵法生产制备超高分子量透明质酸的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]透明质酸(Hyaluronan,HA)是一种广泛存在于微生物胞外的大分子酸性粘多糖，由(1
‑ꢀ
β
‑
4)D
‑
葡糖醛酸(1
‑
β
‑
3)N
‑
乙酰基
‑
D
‑
氨基葡萄糖的双糖重复单位所组成的一种线性聚阴离子电解质。HA粘稠的物理特性使其在眼科手术、关节炎治疗和化妆品制造中扮演重要角色。细胞组织的构架、细胞外液的水分调节、润滑及治疗创伤时均需要透明质酸。
[0003]相比普通分子量透明质酸，超高分子量透明质酸(分子量高于6MDa)有着更为重要的生理功能。它具有更加优秀的保湿功能、促进皮肤营养吸收、增加皮肤弹性并且能够延缓皮肤衰老、促进创伤愈合、调节免疫能力和抗肿瘤。
[0004]目前，在工业领域还没有能够大规模生产超高分子量透明质酸的方法。现有制备超高分子量透明质酸的方法主要依赖组织提取法。部分动物的组织，如裸鼹鼠，富含大量的超高分子量透明质酸，其组织内透明质酸分子量可达到的6
‑
12MDa，是超高分子量透明质酸的主要来源之一；但是动物组织材料来源十分有限，且提取过程繁琐、成本高昂、工艺复杂，透明质酸产物纯度和最终提取的透明质酸分子量极易受到提取过程的影响因而限制了超高分子量透明质酸的实际应用。
[0005]随着我国经济的迅速发展，医药行业对其需求量也越来越大。采用人工提取的方法得到的超高分子透明质酸远远不能满足社会的需求，提纯透明质酸的方法较为困难、成本较高。而兽疫链球菌可致各种炎症和败血症，在工业生产安全问题上具有一定风险。人们需要利用成本较低、安全的微生物发酵法来生产超高分子量透明质酸。

技术实现思路

[0006][技术问题][0007]本专利技术要解决的技术问题是，通过生物合成，如发酵兽疫链球菌，生产透明质酸得到的透明质酸的分子量较低，且因为其致病性在工业生产上具有一定风险。
[0008][技术方案][0009]本专利技术提供了一株能够合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，以工业安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)异源表达透明质酸合酶pmHasA，并通过RBS 弱化和定点突变的方法理性改造透明质酸合酶pmHasA，提高透明质酸合酶合成长链透明质酸的能力；通过构建表达框强化葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶编码基因galU、UDP
‑
葡萄糖脱氢酶编码基因ugd、谷氨酰胺
‑
果糖
‑6‑
磷酸氨基转移酶编码基因glmS、磷酸葡萄糖变位酶编码基因glmM和UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶编码基因 glmU基因的表达，加强透明质酸的合成底物UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺和UDP
‑
葡萄糖醛酸的积累，提高了重组谷氨酸棒杆菌生产超高分子量透明质酸的能力；并在此基础上，
对提纯超高分子量透明质酸的方法进行了优化。
[0010]所述超高分子量透明质酸是指分子量大于6MDa的透明质酸。
[0011]所述重组谷氨酸棒杆菌的宿主选自：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、 Corynebacterium glutamicum K051、Corynebacterium glutamicum ATCC 14067、Corynebacteriumglutamicum MB001、Corynebacterium glutamicum R、Corynebacterium glutamicum S9114、 Corynebacterium glutamicum SCgG1、Corynebacterium glutamicum SCgG2、Corynebacteriumglutamicum Z188、Corynebacterium glutamicum ZL
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2、Corynebacterium glutamicum ZL
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5、 Corynebacterium glutamicum ZL
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6；优选Corynebacterium glutamicum ATCC 13032。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，弱化用于表达透明质酸合成酶pmHasA的编码基因的RBS 序列时，采用的RBS序列为AAGGAGG、AAGGGCC、AAGGCTC、AAGGAAC、AAGGCAT、 AAGGATC或AAGGTTG，其中优选AAGGAGG。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述透明质酸合酶pmHasA来源于多杀性巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述透明质酸合成酶 pmHasA的基因是来源于多杀巴斯德杆菌的，或者人工合成的。或者，透明质酸合成酶pmHasA 还可以是与SEQ ID NO.1有高于60％的氨基酸序列相似性的其他来源的透明质酸合成酶。或者，所述透明质酸合成酶pmHasA是经过定点突变改造的，例如，T104A、V59M、 T104A/K106A/K107A，突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的透明质酸合成酶。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述的谷氨酰胺
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果糖
‑6‑
磷酸氨基转移酶GlmS，磷酸葡萄糖变位酶GlmM，UDP
‑
N
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乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶 GlmU，葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶GalU，UDP
‑
葡萄糖脱氢酶Ugd来源于谷氨酸棒杆菌 Corynebactrium glutamicum。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，GlmU、GalU、Ugd、GlmS和GlmM的启动子为Ptrc、Ppyc、 PglnA、PlysE、PlysG、PilvB、PleuA、PleuB、PthrB、PthrE、PgltB、PlpdA、Prep、Pper、 PorfB、Porf3
‑
aro、PsigA、PaceA、PaceB、Pamt、PctRNA、PbrnF、PbrnE、Plrp；优选Ptrc。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，GlmU、GalU、Ugd、GlmS和GlmM的表达载体选自：pXMJ19、pEC
‑
XK99E、pEC
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)异源表达透明质酸合酶pmHasA，并通过RBS弱化和定点突变改造透明质酸合酶pmHasA；同时，通过构建表达框强化葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶编码基因galU、UDP
‑
葡萄糖脱氢酶编码基因ugd、谷氨酰胺
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果糖
‑6‑
磷酸氨基转移酶编码基因glmS、磷酸葡萄糖变位酶编码基因glmM和UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶编码基因glmU中至少一种基因的表达，加强透明质酸的合成底物UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺和UDP
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葡萄糖醛酸的积累；所述超高分子量透明质酸是指分子量大于6MDa的透明质酸。2.根据权利要求1所述的用于合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌的宿主选自：Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、Corynebacterium glutamicum K051、Corynebacterium glutamicum ATCC 14067、Corynebacterium glutamicum MB001、Corynebacterium glutamicum R、Corynebacterium glutamicum S9114、Corynebacterium glutamicum SCgG1、Corynebacterium glutamicum SCgG2、Corynebacterium glutamicum Z188、Corynebacterium glutamicum ZL
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2、Corynebacterium glutamicum ZL
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5、Corynebacterium glutamicum ZL
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6；优选Corynebacterium glutamicum ATCC 13032。3.根据权利要求1所述的用于合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，弱化用于表达透明质酸合成酶pmHasA的编码基因的RBS序列时，用于替换原RBS序列的RBS序列为AAGGAGG、AAGGGCC、AAGGCTC、AAGGAAC、AAGGCAT、AAGGATC或AAGGTTG。4.根据权利要求1所述的用于合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述透明质酸合酶pmHasA来源于多杀性巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1或4所述的用于合成超高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述定点突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，王阳，堵国成，汪昊，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：