一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术首先在大肠杆菌EcN(Escherichia coli Nissle 1917)中筛选异源表达UDP

【技术实现步骤摘要】
一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]肝素前体(Heparosan)是一种酸性天然产物多糖，是肝素和乙酰肝素的生物合成的前体多糖。肝素前体的骨架是由D
‑
葡萄糖醛酸(GLCA)和N
‑
乙酰
‑
α
‑
D
‑
氨基葡萄糖(GlcNAc)通过α
‑
1,4和β
‑
1,4糖苷键交替连接而成的重复双糖单元组成线性多糖。肝素前体在大肠杆菌K5和多杀性巴氏杆菌等细菌中被生物合成为多糖胶囊。在真核生物中，肝素前体是肝素和硫酸乙酰肝素生物合成的前体，这两种生物分子参与抗凝血，抵抗细菌和病毒的进入，并在血管生成，炎症和癌症的发展中发挥着重要作用，因此生产肝素前体是制备生物工程肝素的第一步。
[0003]肝素首先从动物肝脏中而得名，主要从牛肺和猪小肠中提取。2008年美国发生的肝素钠污染事件使得肝素的安全生产备受关注。化学酶法合成肝素是利用肝素前体制备有活性的肝素。目前大肠杆菌K5、D型多杀型巴斯德杆菌和副鸡禽杆菌等的荚膜中被发现，大肠杆菌K5是一株致病菌，在生产使用过程中存在风险。大肠杆菌Nissle 1917(EcN)是一株益生菌，其血清型为O6:K5:H1，是一株天然产肝素前体又是无毒性安全菌株。
[0004]因此有必要探索、构建安全高效的微生物细胞工厂，提高肝素前体的产量和质量。
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技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提高肝素前体的产量和质量，从而探索并构建一株高效的菌株用于肝素前体的生产。
[0006]为解决上述问题，本专利技术对工业安全菌株大肠杆菌EcN(Eshcherichia coli Nissle 1917)进行改造，进一步将肝素前体合成途径中的关键基因galU、ugd和glmS、glmM以及glmU进行组合优化，促进肝素前体在重组EcN中的积累表达。大幅度提高了肝素前体的产量。
[0007]本专利技术提供了重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌表达葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶GalU、UDP
‑
葡萄糖脱氢酶Ugd、谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶GlmS、磷酸葡萄糖变位酶GlmM和UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶GlmU中的一个或多个，并同时表达β
‑
UDP
‑
葡萄糖醛酸糖基转移酶KfiC和α
‑
UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺糖基转移酶KfiA。
[0008]在一种实施方式中，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶GalU来源于枯草芽孢杆菌、兽疫链球菌和/或谷氨酸棒杆菌。
[0009]在一种实施方式中，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶GalU来源于Bacillus subtilis 168、Streptococcus equi zooepidemicus ATCC 35246和/或Corynebacterium glutamicum ATCC13032。
[0010]在一种实施方式中，来源于Bacillus subtilis 168的GalU的Gene ID:936797；来
glutamicum ATCC13032的GlmU的NCBI登录号为NP_600171.1；Escherichia coli K
‑
12MG1655来源的GlmM的Gene ID:947692。
[0025]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以Eshcherichia coli Nissle 1917为出发菌株。
[0026]一种生产肝素前体的方法，利用所述重组大肠杆菌转化硫胺素生产肝素前体。
[0027]在一种实施方式中，将所述重组菌的细胞加入反应体系中，待OD
600
＝15
‑
20加入IPTG诱导，待反应体系中葡萄糖浓度在4
‑
6g/L时，补加葡萄糖。
[0028]在一种实施方式中，在35
‑
40℃下培养至反应体系中葡萄糖消耗完结束发酵。
[0029]本专利技术提供了所述重组大肠杆菌在制备肝素前体中的应用。
[0030]本专利技术的有益效果：
[0031](1)本专利技术的工程菌为天然产肝素前体的益生菌EcN，并且能够合成肝素前体。
[0032](2)本专利技术通过筛选不同来源肝素前体途径基因，通过组合优化能够是肝素前体产量摇瓶水平达到0.8g/L。
[0033](3)本专利技术过表达合酶基因，肝素前体产量在摇瓶水平上达到1.29g/L，上罐发酵优化肝素前体产量达到10g/L。
附图说明
[0034]图1是重组EcN生产肝素前体代谢途径及相关基因示意图。
[0035]图2是重组大肠杆菌EcN产肝素前体产量图，不同来源肝素前体途径基因过表达与筛选。
[0036]图3是重组大肠杆菌EcN产肝素前体产量图，在图2的基础上进行组合筛选，其中glmS来源是兽疫链球菌，galU来源是枯草芽孢杆菌，ugd和glmM来源是大肠杆菌K12。
[0037]图4是重组大肠杆菌EcN产肝素前体产量图，途径基因组合的基础上过表达合酶基因kfiAC，其中AUgM是途径基因galU，ugd和glmM以质粒pERCS表达；合酶基因kfiAC以质粒pETDuet表达。
具体实施方式
[0038]材料：
[0039]1、Escherichi coli Nissle 1917，Escherichia coli K
‑
12MG1655，Bacillus subtilis 168，Streptococcus equi zooepidemicus ATCC 35246，Corynebacterium glutamicum ATCC13032和Pseudomonas putida KT2440为本实验室保存。
[0040]2、PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
[0041]3、ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
[0042]4、胶回收试剂盒购自Thermo fisher Scientific公司。
[0043]5、质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
[0044]6、各种分析纯试剂购自国药集团。
[0045]7、LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
[0046]8、LB液体培养基(g/L)：蛋白胨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌表达葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶、UDP
‑
葡萄糖脱氢酶、谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶中的一个或多个，并同时表达β
‑
UDP
‑
葡萄糖醛酸糖基转移酶和α
‑
UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺糖基转移酶。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰胺转移酶来源于枯草芽孢杆菌、兽疫链球菌或谷氨酸棒杆菌；所述UDP
‑
葡萄糖脱氢酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或恶臭假单胞菌；在一种实施方式中，所述谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶来源于枯草芽孢杆菌或兽疫链球菌；所述磷酸葡萄糖变位酶来源于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；所述UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖
‑1‑
磷酸乙酰转移酶双功能酶来源于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。3.根据权利要求2所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰转移酶、大肠杆菌来源的UDP
‑
葡萄糖脱氢酶、兽疫链球菌来源的谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶；或同时表达大肠杆菌来源的UDP
‑
葡萄糖脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶、兽疫链球菌来源的谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶。4.根据权利要求3所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖
‑6‑
磷酸尿酰转移酶、大肠杆菌来源的UDP
‑
葡萄糖脱氢酶；或同时表达兽疫链球菌来源的谷氨酰胺
‑
果糖
‑
6磷酸氨基转移酶和大肠杆菌来源的磷酸葡萄糖变位酶。5.根据权利要求4所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述来源于枯草芽孢杆菌的葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，王阳，胡珊，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：