一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品制造技术

本发明专利技术公开了一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品。所述改造菌具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列。本发明专利技术提供的改造菌株，通过益生菌定植于肠道环境中，持续表达色氨酸羟化酶，进而持续催化产生5羟色胺，从而稳定持续的促进肠动力，提供稳定可靠的缓解便秘的效果，可用于制备促肠动力制剂，缓解便秘制剂。缓解便秘制剂。缓解便秘制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品。

技术介绍

[0002]目前发现一些物质可以作用于肠神经，引起平滑肌收缩、增加肠道动力、缩短肠道运输时间、减少粪便内水分的回收，具有缓解便秘的功效，即促肠动力制剂。
[0003]现有的促肠动力制剂，主要有小分子药物类，例如莫沙比利：作用于肠神经的五羟色胺受体，促进胃肠道动力；伊托比利通过抗多巴胺受体和抑制胆碱酯酶的作用促进胃肠道动力；普鲁卡比利：五羟色胺受体激动剂，激动五羟色胺受体，引起肠道高幅推进性收缩，加快结肠传输。一些益生菌亦可作为促肠动力制剂，常用的促肠动力益生菌主要包括乳酸杆菌、双歧杆菌及乳球菌、粪链球菌、酿酒酵母菌等部分革兰阳性球菌等，其作用机制可能与益生菌代谢产生有机酸，降低肠内pH值，从而调节胃肠功能及改变患者的肠道菌群有关。
[0004]小分子药物类促肠动力制剂，副作用明显，不能长期反复给药，不适合长期、反复便秘发作的患者。而益生菌类促肠动力制剂，由于机理不明确，其缓解便秘的效果不稳定，往往因人而异。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品，其目的在于，通过改造菌株定植于肠道，稳定可控的表达色氨酸羟化酶，持续、高效的产生五羟色胺，持续促进肠道动力，由此解决现有的小分子药物类促肠动力制剂负作用明显，益生菌类促肠动力制剂效果不稳定的技术问题。
[0006]为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种改造菌株，其具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列。
[0007]优选地，所述改造菌株，其所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列。
[0008]优选地，所述改造菌株，其色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述优选色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQ ID NO:2。
[0009]优选地，所述改造菌株，其表达载体的表达区还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件。
[0010]优选地，所述改造菌株，其色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件为阿拉伯糖操纵子调控蛋白基因序列。
[0011]优选地，所述改造菌株，其表达载体的表达区还包括筛选标记基因序列。
[0012]优选地，所述改造菌株，其筛选标记基因为抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。
[0013]优选地，所述改造菌株，其表达载体改造自pBAD24载体，所述改造菌株为EcN pTPH
菌株。
[0014]按照本专利技术的另一个方面，提供了一种所述的改造菌株的应用，其应用于制备促进肠动力制剂。
[0015]按照本专利技术的另一个方面，提供了一种促进肠动力制剂，其包括本专利技术提供的改造菌株；优选还包括阿拉伯糖。
[0016]总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
[0017]本专利技术提供的改造菌株，通过益生菌定植于肠道环境中，持续表达色氨酸羟化酶，进而持续催化产生5羟色胺，从而稳定持续的促进肠动力，提供稳定可靠的缓解便秘的效果，可用于制备促肠动力制剂，缓解便秘制剂。
[0018]优选方案，配合表达调控元件和筛选基因，能使得色氨酸羟化酶的表达量可控，可精准的控制给药，减轻过度给药带来的副作用。
附图说明
[0019]图1是pBAD
‑
hTPH1表达载体结构示意图；
[0020]图2是表达载体凝胶电泳结果图；
[0021]图3本专利技术实施例3
‑
5的流程示意图；
[0022]图4是实施例3粪便水含量测试结果图；
[0023]图5是实施例4实验终点小鼠胃肠道传输速率测试结果图；
[0024]图6是实施例5排便时长测试结果图。
具体实施方式
[0025]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0026]一种改造菌株，具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列，优选还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件、以及筛选标记基因序列；
[0027]所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列；优选所述色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQ ID NO:2。所述色氨酸羟化酶TPH1的表达序列插入载体表达区6
×
His组氨酸标签后。在优选pBAD24表达载体6
×
His处插入所述优选色氨酸羟化酶TPH1序列，便于对蛋白进行纯化和抗体结合，利于后期纯化蛋白、体外验证效果。
[0028]所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件，优选为阿拉伯糖操纵子调控蛋白基因序列，所述阿拉伯糖操纵子调控蛋白为araC蛋白，其可编码一种在大肠杆菌中调控araBAD启动子的蛋白质。在没有L
‑
阿拉伯糖或葡萄糖存在的情况下，araC蛋白抑制araBAD启动子的表达，在有L
‑
阿拉伯糖的情况下激活其调控的基因进行转录。
[0029]所述筛选标记基因为抗生素抗性基因，优选为氨苄青霉素抗性基因(Amp抗性基
因)。
[0030]所述表达载体优选改造自pBAD24载体；pBAD24载体中复制子pBR322ori能够在EcN菌株中发挥作用，能够实现所述pBAD
‑
hTPH1表达载体在EcN菌株中重组表达效果。
[0031]所述改造菌株为EcN pTPH菌株，将所述表达载体pBAD
‑
hTPH1电转入大肠杆菌Nissle 1917感受态细胞中，获得改造菌株EcN pTPH菌株。
[0032]前期体外实验证明所述色氨酸羟化酶TPH1的转化效率最高，利于重组载体的构建，一方面通过密码子优化使其在EcN pTPH菌株具有稳定可控的表达效率，实现可控表达，具有良好的安全性；另一方面根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选，经过优化的基因序列能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
[0033]所述改造菌株内的pBAD
‑
hTPH1表达载体能够通过口服阿拉伯糖诱导表达蛋白，实现体外诱导调控，调控重组载体表达产物色氨酸羟化酶TPH1的表达量，控制给药剂量，避免过度表达可能导致其他的副作用；其抗性基因表达的氨苄青霉素是临床经常使用的一种抗生素，这种抗生素安全性比较高。而重组表达载体中的复制子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改造菌株，其特征在于，具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列。2.如权利要求1所述的改造菌株，其特征在于，所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列。3.如权利要求2所述的改造菌株，其特征在于，所述色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述优选色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQ ID NO:2。4.如权利要求1至3任意一项所述的改造菌株，其特征在于，所述表达载体的表达区还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件。5.如权利要求4所述的改造菌株，其特征在于，所述色氨酸羟化酶TPH...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘智，李蓓，罗亚楠，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：