一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。本发明专利技术敲除了大肠杆菌MG1655基因组上O

【技术实现步骤摘要】
一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌


[0001]本专利技术涉及一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。

技术介绍

[0002]百日咳杆菌脂寡糖(LOS)由类脂A与十二个单糖构成的寡糖连接而成，远端具有独特的三糖结构单元，包括两种罕见糖2,3
‑
乙酰氨基
‑
2,3
‑
双脱氧
‑
甘露糖醛酸和2
‑
乙酰氨基
‑4‑
N
‑
甲基
‑
2,4
‑
双脱氧
‑
岩藻糖。各种百日咳杆菌菌株LOS结构高度保守，在疫苗接种前后的临床分离株中LOS末端三糖结构单元也没有改变，说明LOS末端三糖结构单元是广谱抗百日咳疫苗的理想成分。百日咳患者血清中含有各种抗百日咳杆菌抗体，但只有针对LOS的抗体有杀菌抗体的靶点。LOS末端三糖结构单元是杀菌抗体的靶标位点，能有效地固定补体，与杀菌活性相关性最好。它可以与抗LOS单克隆抗体结合，作为疫苗的一个合适表位靶点。
[0003]然而，用百日咳杆菌制备这个新型抗原存在瓶颈问题。首先，百日咳杆菌天然合成的脂寡糖只含有单个末端三糖单元；其次，百日咳杆菌为致病菌，存在安全生产隐患。百日咳杆菌细胞中糖酵解途径和TCA循环存在缺陷，造成其生长缓慢。因此，提供一种简单有效的制备百日咳杆菌寡糖抗原是有迫切需求的。

技术实现思路

[0004]为了解决上述存在的技术问题，本专利技术在大肠杆菌中敲除基因组上四个与LPS相关的基因簇wbbL
‑
galF，rfaD
‑
waaQ，rfe
‑
rffM和wcaM
‑
wza和结合转录抑制因子基因metJ得到LPS精简菌株MDCO020。随后将携带百日咳杆菌核心糖基因簇的质粒pW，携带有百日咳杆菌三糖单元基因簇的质粒pB和能增加三糖重复单位基因簇的质粒pD5转化到LPS精简菌株MDCO020中，得到重组菌MDCO020/pWpBpD5。通过SDS
‑
PAGE和核磁共振分析(1HNMR)确定了MDCO020/pWpBpD5菌株的LPS结构为在大肠杆菌自身Kdo2‑
lipidA的结构上加入百日咳杆菌CS菌株的核心寡糖组分以及多个末端三糖单元组分。在相同发酵条件下，MDCO020/pWpBpD5菌株合成细胞干重是CS菌株的1.63倍；MDCO020/pWpBpD5菌株LPS产量是CS菌株的2倍。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种生产百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O
‑
抗原基因簇，核心糖基因簇，肠共同抗原基因簇，克拉酸基因簇和结合转录抑制因子基因，并过表达了百日咳杆菌来源的核心糖基因簇和末端三糖基因簇以及铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇。
[0006]在一种实施方式中，所述O
‑
抗原基因簇为wbbL
‑
galF。
[0007]在一种实施方式中，所述O
‑
抗原基因簇wbbL
‑
galF包含12个基因，分别为wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_416544.1"、"NP_
416545.1"、"NP_416546.1"。
[0008]在一种实施方式中，所述核心糖基因簇为rfaD
‑
waaQ。
[0009]在一种实施方式中，所述核心糖基因簇rfaD
‑
waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_418085.1"、"NP_418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"。
[0010]在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇为rfe
‑
rffM。
[0011]在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇rfe
‑
rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_418242.1"。
[0012]在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇为wcaM
‑
wza。
[0013]在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇wcaM
‑
wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416566.1"、"NP_416565.1"、"NP_416564.1"、"NP_416563.1"、"NP_416562.1"、"NP_416561.1"、"NP_416560.1"、"NP_416559.1"、"NP_416558.1"、"NP_416557.1"、"NP_416556.1"、"NP_416555.1"、"NP_416554.1"、"NP_416553.1"、"NP_416552.1"、"NP_416551.1"、"NP_416550.1"、"NP_416549.1"、"NP_416548.1"、"NP_416547.1"。
[0014]在一种实施方式中，所述结合转录抑制因子基因metJ的序列的NCBI上登录号为NP_418373.1。
[0015]在一种实施方式中，所述百日咳核心糖基因簇包含基因的序列的NCBI登录号分别为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O
‑
抗原基因簇，核心糖基因簇，肠共同抗原基因簇，克拉酸基因簇和结合转录抑制因子基因，并过表达了百日咳杆菌来源的核心糖基因簇和末端三糖基因簇以及铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述O
‑
抗原基因簇wbbL
‑
galF包含12个基因，分别为wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_416544.1"、"NP_416545.1"、"NP_416546.1"；所述核心糖基因簇rfaD
‑
waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_418085.1"、"NP_418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述肠共同抗原基因簇rfe
‑
rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_418242.1"；所述克拉酸基因簇wcaM
‑
wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wc...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，王震，范锋锋，汪宸卉，胡浩，
申请(专利权)人：苏州微超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：