一种人源化纳米抗体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体公开了一种抗TNFα纳米抗体的人源化改造方法，本发明专利技术公开的人源化改造的抗TNFα纳米抗体核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.12；其改造方法包括以下步骤：确定FR2区三种关键氨基酸单突变与联合突变，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10所示；进一步多重序列对比确定人源化方案；通过上述得到人源化抗TNFα纳米抗体；经酵母表达系统表达。本发明专利技术改造的人源化抗TNFα纳米抗体，能保留较高的抗原亲和力，热稳定性以及生物活性，为今后人源化纳米抗体的疾病治疗药物的开发奠定基础。

A humanized nano antibody and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种人源化纳米抗体及其制备方法
本专利技术属于纳米抗体，具体涉及一种抗TNFα纳米抗体(NbTNFα)的人源化方法及其制备。
技术介绍
肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种研究最热门的多效应细胞因子，主要由活化的巨噬细胞分泌，同时淋巴细胞、可扑弗氏细胞、平滑肌细胞以及黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞也可以分泌。它不仅是炎症反应的关键介质，同时也可以通过调节信号转导引起细胞的凋亡与坏死。最近有新的研究发现，靶向TNFα的阻断剂在治疗相关疾病时，会引起糖尿病，银屑病，多发性硬化症等多种自身免疫疾病。另外，更多的研究也发现TNFα与肿瘤之间有着密切的关系，一方面低浓度的TNFα可以通过多种信号途径参与肿瘤的发生发展，另一方面高浓度的TNFα具有较强的抗肿瘤作用。目前对于TNFα的研究越来越深入，同时TNFα作为最成熟的靶点。目前已经多种TNFα抗体药物上市，其中包括三个进口(类克、恩利、修美乐)，三个国产(益赛普、强克、安百诺)。纳米抗体(nanobody)是一种特殊的小分子抗体，是从骆驼血清中分离出的一种缺失轻链和CH1恒定区的重链抗体，通过克隆其可变区可得到重链单域抗体(variabledomainoftheheavy-chainofheavy-chainantibody,VHH)即纳米抗体。它作为一种小分子抗体，具有传统抗体不具备的优势，1)分子量小，仅为15Kd，是传统单抗的1/10，具有强而快的穿透力，极易于穿过血管或组织到达靶部位，同时由于其能穿透血脑屏障，为脑部给药提供了新方法；2)稳定性好，研究发现，将纳米抗体放置在37℃一周以上，发现其仍然能保持80％以上的抗原结合能力，而单链抗体却发生了聚集与失活；同时有人将纳米抗体与单抗长期放置在90℃以及强变性剂下，发现纳米抗体仍保持很高的活性，而单抗已完全失活，发生不可逆性的聚合，这使得纳米抗体在常温条件下以及恶劣环境下更容易保存与运输；3)与单抗相比，纳米抗体有较长的CDR3区，这个CDR3形成凸出的环状可以特异性的识别隐藏的抗原表位，而这些表位是常规抗体无法识别的；4)纳米抗体结构简单，可以在细菌以及酵母中大量表达。这些优势都是常规抗体以及其他小分子抗体(Fab，Fv，scFv等)不具备的，因此纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的发展机遇。目前进入临床阶段的纳米抗体主要以双价、多价、PEG修饰、Fc融合以及白蛋白融合等多种形式出现，这样做不仅增加药物的治疗疗效，同时也可以延长药物半衰期。但随着分子量的不断增大，纳米抗体的免疫原性也不得不被人们所关注，目前处于临床试验的纳米抗体部分为人源化纳米抗体，因此寻找一种简单，方便且对活性影响不大的人源化改造方法越来越得到人们的关注。与鼠源抗体一样，纳米抗体人源化的一般原则是在能有效地降低免疫原性的同时，能够保证较高的亲和力、热稳定性、活性和产量等。目前对于纳米抗体进行人源化改造主要有以下两种方法：表面氨基酸人源化法：根据相关文献报道，纳米抗体与人抗体重链可变区结构很相似，且同源性高达80-90％，另外，通过分析骆驼的VHH胚系基因序列，发现其与人源VH基因III家族具有很高的同源性。通过序列比较，发现其骨架区表面约有十几个氨基酸不同，其中最重要的是FR2骨架区，人源抗体VH的42、49、50、52位氨基酸主要为疏水性残基且相对保守，通常与VL相互作用，参与形成VH-VL界面，而VHH主要为亲水性残基，使得VHH在缺失轻链的情况下仍具有很好的水溶性，并且研究也发现VHHFR2骨架区的这几个残基也与CDR3构象有密切的关系。因此对于人源化改造首先研究FR2这几个残基对CDR构象的影响，对影响较大的残基予以保留。其次对FR1，FR3与FR4表面氨基酸进行人源化突变，由于这三个FR区对CDR的构象影响不大，可借助模拟分析或序列对比的方法选择突变位点。VHH人源化通用框架移植法：Vincke等人利用人源VH基因III家族的抗体胚系基因DP-47作为模板，对β-内酰胺酶纳米抗体(NbBcII10)进行人源化改造，得到了最大程度人源化NbBcII10FGLA纳米抗体(h-NbBcII10FGLA)。它在降低免疫原性的基础上，不仅保留抗体的亲和力和溶解性，而且热稳定性也有一定程度的提高。同时有相关研究将不同来源的纳米抗体的CDR区嫁接到人源化通用框架h-NbBcII10FGLA的骨架区产生的人源化纳米抗体，通过比较发现移植前后亲和力与热稳定性并没有发生很明显的改变，而且生物活性影响也不明显，因此h-NbBcII10FGLA是目前设计出较理想的一个人源化纳米抗体通用模板。目前，针对TNFα纳米抗体(专利号：CN103333253A)已进行了表达制备及抗乳腺癌肿瘤方面的研究，但该抗TNFα纳米抗体的人源化并无文献报道。本专利技术完成了TNFα的人源化改造并对其TNFα结合活性进行了验证，获得具有高亲和性的TNFα人源化纳米抗体，为进一步开发针对自身免疫性疾病和肿瘤疾病的治疗性TNFα纳米抗体药物奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗TNFα纳米抗体人源化的方法，可以为以后制备人源化纳米抗体奠定一定的基础。本专利技术公开了TNFα纳米抗体FR2区42，50，52位关键氨基酸单突变以及组合突变序列，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，3，5，7，9；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2，4，6，8，10。本专利技术公开的一种人源化改造的抗TNFα纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；氨基酸序列，如SEQ.ID.NO.12所示。本专利技术还公开了抗TNFα纳米抗体的人源化改造方法，包括以下步骤：1)通过IMGT抗体CDRs区Numbering方案，对抗TNFα纳米抗体的CDRs与FR进行分区；2)将对CDR3构象有影响的FR2骨架区的第42，50以及52位关键氨基酸进行不同组合突变，已经确定50和52位氨基酸共突变对构象影响不大；3)将抗TNFα纳米抗体的序列通过IgBLAST进行序列相似性搜索，搜索出与其序列同源性较高的人抗体胚系基因序列，并利用MEGA5.0软件对抗TNFα纳米抗体与人抗体胚系基因序列进行多重序列对比；4)人源化方案的制定：根据步骤2)和3)的分析结果，对抗TNFα纳米抗体进行合理的人源化设计，包括以下步骤：4.1)FR骨架区不能替换的氨基酸残基：第42位的苯丙氨酸不能替换；CDR区外侧邻近的残基(一般为邻近的两个氨基酸残基)往往对CDR构象有较大的影响；4.2)FR骨架区不需要替换的残基：在人源抗体序列变化范围之内的残基可不用进行替换；4.3)FR骨架区可以替换的残基：人源抗体序列独有的可以考虑进行替换；4.4)FR骨架区需要考虑的残基：同时替换连续的几个残基可能对CDR构象有一定的影响。本专利技术还公开了人源化改造的TNFα纳米抗体表达及活性验证方法，包括以下步骤：1)将人源化改造的抗TNFα纳米抗体(h-NbTNFα)通过PCR扩增，酶切酶连的方式连接到pPICZαA质粒；2)对上述1)得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化抗TNFα纳米抗体，其特征在于，所述人源化抗TNFα纳米抗体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源化抗TNFα纳米抗体，其特征在于，所述人源化抗TNFα纳米抗体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。


2.根据权利要求1所述的一种人源化抗TNFα纳米抗体，其特征在于，编码人源化抗TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.12所示。


3.根据权利要求1所述的一种人源化抗TNFα纳米抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)通过IMGT抗体CDRs区Numbering方案，对抗TNFα纳米抗体的CDRs与FR进行分区；
2)将对CDR3构象有影响的FR2骨架区的第42，50以及52位关键氨基酸进行不同组合突变，突变TNFα纳米抗体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO....

【专利技术属性】
技术研发人员：纪雪梅，刘煜，赵明军，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32