制备pH依赖性抗体的方法技术

公开了用于制备表现出改善的pH依赖性抗原结合的工程化抗体的方法。所述方法基于在抗体CDR内的限定的氨基酸位置的子集处引入组氨酸残基。用于组氨酸替换的所选氨基酸位置的组来源于来自天然抗体库之功能性抗体的CDR内的组氨酸存在的热图。所述方法提供了鉴定pH依赖性抗体变体的更简单且耗时更少的方法。

Methods of preparing pH dependent antibody

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备pH依赖性抗体的方法
本公开内容涉及抗体工程化的领域，并且具体地涉及用于对表现出与靶抗原pH依赖性结合的抗体变体进行工程化的方法，以及通过该方法制备的抗体。
技术介绍
对表现出与靶抗原pH依赖性结合的抗体的工程化存在日益增长的兴趣。特别地，令人感兴趣的是鉴定与中性pH相比在酸性pH下表现出降低的抗原结合的抗体。并入pH敏感型抗原结合可导致体内工程化抗体的功能改善。抗体可以是经工程化的以在中性pH(例如pH7.4)下保持高亲和力抗原结合并且在酸性pH(例如pH4.5至6.0)下显示出降低的结合。当进入内体途径时，pH依赖性抗原结合允许抗体-抗原复合物在酸化的内体(约pH6.0)中解离和FcRn介导的游离抗体的再循环，进而促进增强的抗原清除，这可使得能够进行更低频率地或更低地抗体给药。通常，pH依赖性抗体-抗原结合依赖于可电离的组氨酸残基的存在，所述组氨酸残基介导相互作用的抗体的结合或折叠中的结构转变。在较低的pH值下的组氨酸质子化之后诱导的静电相互作用的改变可导致结合亲和力降低。已经描述了多种蛋白质工程化方法，其目的是通过使用不同的组氨酸替换策略将pH敏感性并入到蛋白质中。例如，由粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，GCSF)受体相互作用位点的结构建模指导的合理设计能够鉴定在组氨酸替换之后导致pH敏感型变体的突变位点(Sarkar等，NatBiotechnol，Vol.20，pp908-13，2002)。然而，评估可介导蛋白质中的pH敏感性的组氨酸替换的单独位置是耗时且不可预测的。作为一种替代方法，用合适的高通量技术(例如，酵母表面展示(yeastsurfacedisplay，YSD)或噬菌体展示)筛选组合文库已经应用于多种不同蛋白质骨架中的pH敏感型结合的工程化。等，mAbs，vol.7(1)，138-151，2015描述了针对可逆的pH敏感型抗原结合，对抗体重链和轻链可变结构域进行工程化的通用策略。这种方法依赖于重链和轻链组合的组氨酸替换文库的产生和筛选。在这种方法中，将组氨酸突变随机引入到VH和VL区的互补决定区(complementary-determiningregion，CDR)中。组氨酸突变可被引入至VH结构域和VL结构域的CDR中的任何氨基酸位置处。调整组氨酸突变的速率以实现每个文库变体的平均三个随机突变。因此，完整的文库理论上包含含有CDR中三个随机组氨酸替换的所有可能组合的变体。这种组合文库方法确实能够成功地鉴定表现出与TNFpH依赖性结合的阿达木单抗(adalimumab)的工程化变体。然而，由于针对可能的组氨酸替换对VH和VL结构域的CDR内的所有氨基酸位置进行采样所需的文库规模大，因此该策略是相对耗时的。此外，没有考虑通过在不利位置处引入组氨酸残基的总体抗体结构和稳定性。专利技术概述需要用于制备表现出与靶抗原pH依赖性结合的工程化抗体变体的替代方法，其比现有技术的方法执行起来更简单且耗时更少。此外，还需要能够鉴定表现出pH依赖性抗原结合的工程化抗体而不会不适当地影响中性pH下的抗原结合能力的方法。为了满足这些需求，申请人已经对功能性(即抗原结合)抗体可变结构域的大库的互补决定区(CDR)内组氨酸残基的天然存在进行了系统分析。该分析的结果使得申请人能够得到天然抗体内的天然组氨酸存在的“热图(heat-map)”。“热图”不仅提供了CDR内的“热点(hot-spot)”氨基酸残基(在此处组氨酸可天然存在于抗体库内)的列表，还提供了CDR中的“冷点(cold-spot)”氨基酸残基(在此处组氨酸通常不天然存在)的列表。“热点”和“冷点”列表可例如以合理的设计或组合的方法应用于pH依赖性抗体变体的工程化。在第一方面中，本专利技术提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：VHCDR1H34，H35a，H35b，H35cVHCDR2H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65VHCDR3H100g，H100k，H100m，H100nVLCDR1L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33VLCDR2L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56VLCDR3L95，L95d，L95e，L95f，L97其中所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合。由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。本专利技术还提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：(a)提供与抗原结合的亲本抗体；(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：VHCDR1H34，H35a，H35b，H35cVHCDR2H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65VHCDR3H100g，H100k，H100m，H100nVLCDR1L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33VLCDR2L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56VLCDR3L95，L95d，L95e，L95f，L97(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。由于组氨酸替换，与亲本抗体相比，步骤(c)中鉴定的工程化抗体表现出改善的pH依赖性结合(即更大的pH依赖性)。本专利技术还提供了制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：并且来自以下冷点列表的至少一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170510 GB 1707484.01.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括通过用组氨酸残基替换亲本抗体的至少一个氨基酸残基来制备所述工程化抗体，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：



并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








VHCDR1
H34，H35a，H35b，H35c


VHCDR2
H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65


VHCDR3
H100g，H100k，H100m，H100n


VLCDR1
L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33


VLCDR2
L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56


VLCDR3
L95，L95d，L95e，L95f，L97






其中所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合。


2.权利要求1所述的方法，其中所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。


3.权利要求1所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。


4.权利要求1所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。


5.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。


6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少两个氨基酸残基被替换为组氨酸。


7.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少三个氨基酸残基被替换为组氨酸。


8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自所述热点列表的至少四个氨基酸残基被替换为组氨酸。


9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中以下残基中的一个或更多个也被替换为组氨酸：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97。


10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的至少两个氨基酸残基未被替换为组氨酸。


11.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的至少三个氨基酸残基未被替换为组氨酸。


12.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自所述冷点列表的VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1和VLCDR2的氨基酸残基均未被替换为组氨酸。


13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述亲本抗体或其CDR来源于骆驼科物种。


14.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)提供与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：



并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








VHCDR1
H34，H35a，H35b，H35c


VHCDR2
H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65


VHCDR3
H100g，H100k，H100m，H100n


VLCDR1
L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33


VLCDR2
L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56


VLCDR3
L95，L95d，L95e，L95f，L97






；
(c)针对与所述抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定表现出与所述抗原pH依赖性结合的工程化抗体。


15.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体在酸性pH下对其抗原的亲和力低于在中性pH下的亲和力。


16.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。


17.权利要求14所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)高于酸性pH下的亲本抗体-抗原相互作用的解离速率常数(kd)。


18.权利要求14或权利要求15所述的方法，其中在部分(c)中鉴定的所述工程化抗体的特征在于：酸性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)高于中性pH下的工程化抗体-抗原相互作用的平衡解离常数(KD)。


19.权利要求14至18中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VH结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：



并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








VHCDR1
H34，H35a，H35b，H35c


VHCDR2
H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65


VHCDR3
H100g，H100k，H100m，H100n






。


20.权利要求14至18中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于VL结构域中的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：



并且选自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








VLCDR1
L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33


VLCDR2
L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56


VLCDR3
L95，L95d，L95e，L95f，L97






。


21.权利要求20所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于λ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：








CDR1
L30，L31，L32，L34，


CDR2
L51，L52，L53，L55，


CDR3
L89，L91，L92，L93，L95a，L95b，L95c，L96






并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








CDR1
L24，L25，L26，L27，L27a，L27b，L27c，L27d，L27e，L28，L29，L33


CDR2
L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L54，L56


CDR3
L90，L94，L95，L95d，L95e，L95f，L97






。


22.权利要求20所述的方法，其中所述亲本抗体的所述VL结构域属于κ类，并且其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：








CDR1
L27，L27d，L29，L31，L32


CDR2
L53，L54，L55


CDR3
L89，L90，L91，L92，L93，L94，L96






并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








CDR1
L24，L25，L26，L27A，L27b，L27c，L27e，127f，L28，L30，L33，L34


CDR2
L50，L51，L51a，L51b，L51c，L51d，L52，L56


CDR3
L95，L95a，L95b，L95c，L95d，L95e，L95f，L97






。


23.制备工程化抗体的方法，所述工程化抗体表现出与其抗原的pH依赖性结合，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定与抗原结合的亲本抗体；
(b)制备所述亲本抗体的工程化变体的组，其中所述组中的每种所述工程化变体与所述亲本抗体的不同之处在于至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸残基，其中选自以下热点列表的至少一个氨基酸残基被替换为组氨酸：



并且来自以下冷点列表的至少一个氨基酸残基未被替换为组氨酸：








VHCDR1
H34，H35a，H35b，H35c


VHCDR2
H51，H52b，H52c，H54，H55，H57，H60，H61，H64，H65


VHCDR3
H100g，H100k，H100m，H100n


VLCDR1
L24，L25，L26，L27a，L27b，L27c，L27e，L28，L33


VLCDR2
L50，L51a，L51b，L51c，L51d，L56


VLCDR3
L95，L95d，L95e，L95f，L97






；
(c)针对与所述靶抗原的pH依赖性结合，筛选所述工程化变体的组，并且由此鉴定所选氨基酸位置，在所述氨基酸位置处组氨酸的存在赋予与所述抗原的pH依赖性结合；
(d)制备所述亲本抗体的一种或更多种另外...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗·布朗什托，埃里克·霍夫曼，乔纳斯·德哈德，雅各布斯·科内利斯·拉塞尔，
申请(专利权)人：阿尔金克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE