用于纯化重组抗体片段的方法技术

本发明专利技术涉及从在微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组抗体片段的方法。更具体地，本发明专利技术涉及用于从微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组人源化(rHu)抗体片段雷珠单抗的方法。

Methods for purification of recombinant antibody fragments

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化重组抗体片段的方法
本专利技术涉及用于从在微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组抗体片段的方法。更具体地，本专利技术涉及用于从微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组人源化(rHu)抗体片段雷珠单抗(Ranibizumab)的方法。
技术介绍
生物制药研究和开发的近期趋势更集中于抗体片段的开发。尽管相比以前正在开发大量的生物相似性治疗蛋白质，但生物相似性产品开发中的关键挑战是更高的下游处理成本、非选择性清除工艺和产品相关杂质、产品的蛋白水解降解等。抗体片段提供了超过完整大小的单克隆抗体(mAb)治疗剂的某些优点(诸如改善的和深度的肿瘤穿透，结合到不能接近完整大小mAb的特定表位等)。Fab占已经进入临床开发的抗体片段候选物的大多数，并且三种已被美国FDA批准。上游工艺(例如高滴度克隆和连续生物制造)的进步已经将生物制药工业的焦点移向提高整个下游工艺经济。下游处理组成用于单克隆抗体治疗剂总制造成本的约60-70％。下游处理的捕获、中间和精制步骤涉及各种层析操作的广泛使用。雷珠单抗是一种VEGF-A(血管内皮生长因子-A)拮抗剂，其结合并抑制人VEGF-A的活性形式的生物功能。VEGF-A的过度上调使其在新血管的生长中起关键作用，导致血管生成和血管的通透性过高。血管的通透性可能导致黄斑水肿和脉络膜新血管生成，从而引起湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)。因此，为了控制和治疗血管的通透性过高的疾病状态，必须通过VEGF-A拮抗剂抑制VEGF-A。雷珠单抗在药物制剂中是商业上可获得的，如并且通过玻璃体内注射施用。其被特别设计和制造用于眼内使用。雷珠单抗是重组人源化IgG1κ同种型单克隆抗体片段，其在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的治疗中被设计用于眼内使用。雷珠单抗的分子量约为48.37kDa，即对于轻链和重链分别为23.43kDa和24.95kDa。所述人源化单克隆抗体片段通过重组DNA技术在大肠杆菌细胞中表达，并靶向人血管内皮生长因子A(VEGF-A)。雷珠单抗是轻链的C末端通过二硫键与重链的231个残基的N末端部分连接的214个残基的轻链。现有技术文献提供了关注抗体片段的表达及其纯化的证据。然而，使用大肠杆菌细胞产生的重组人源化(rHu)雷珠单抗以不溶解的蛋白质聚集体的形式形成包涵体。US20160289314公开了用于制备雷珠单抗的克隆、表达和纯化方法。纯化方法仅涉及溶解的包涵体的还原、氧化和体外重折叠，接着超滤和渗滤-I、阴离子交换层析、阳离子交换层析、超滤和渗滤-II及过滤的逐步过程。该方法中的多个纯化步骤导致低通量操作，从而使该方法繁琐。因此，迫切需要提供一种便捷的下游程序以获得纯化的抗体片段。鉴于现有技术公开的下游纯化程序带来的缺点，本专利技术人已经尝试提供一种用于纯化抗体片段的方法。通过本专利技术获得的所得纯化的抗体片段满足并符合创新产品的纯度和活性标准。专利技术目的本专利技术的主要目的因此是提供一种用于纯化抗体片段的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种通过将多元层析纯化步骤与rHu雷珠单抗下游处理整合的用于纯化重组雷珠单抗的方法。本专利技术的又一个目的是提供一种方法，所述方法导致生产率比现有的制造方法提高近两倍。本专利技术再一个目的是提供一种方法，其中开发的纯化平台适用体外重折叠的和可溶的表达的抗体片段。专利技术概述本专利技术提供了一种用于纯化重组抗体片段的方法。在一个实施方案中，本专利技术涉及一种用于纯化来自重组宿主细胞的重组人雷珠单抗的方法，所述方法包括：获得来自重组宿主细胞中的以包涵体的形式的rHu雷珠单抗；使用溶解缓冲液溶解包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；使用重折叠缓冲液重折叠溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；通过超滤浓缩重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的rHu雷珠单抗；将浓缩的rHu雷珠单抗进行顺序多元层析纯化步骤以除去与产物相关的杂质、宿主细胞蛋白质和宿主细胞核酸，随后渗滤和超滤以获得纯化的rHu雷珠单抗。在另一个实施方案中，本专利技术提供了多元层析纯化阶段，包含以下步骤；(i)将浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进行多元层析，将具有范围为4.0至10.0的pH的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mMTrisHCl和0mM至150mMNaCl或20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mMNaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH；(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池(elutionpool)中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mMTrisHCl和0mM至1000mM氯化钠或20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mMNaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH，其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；(iii)将从步骤(ii)获得的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，并进一步用包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mMNaCl的缓冲液除去杂质，所述从步骤(ii)获得的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；(iv)在包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mMNaCl的洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0.3％的聚集形式的rHu雷珠单抗。在再一个实施方案中，本专利技术提供了一种多元层析的方法，其中所述多元层析I和II期的顺序是可互换的。在又一个实施方案中，本专利技术提供了通过纯化雷珠单抗的下游方法获得的重组人源化雷珠单抗。提供本概述以介绍与纯化重组人抗体片段(rHu雷珠单抗)的方法相关的构思。本概述不旨在确定请求保护的主题的必要特征，也不旨在用于确定或限制请求保护的主题的范围。附图说明图1描述用于请求保护的多元层析纯化平台的方法步骤；图2描述多元层析I的层析谱，洗脱峰I：纯化的rHu雷珠单抗，洗脱峰II：与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)；图3描述多元层析II的层析谱，流穿液和洗脱峰I：与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)。洗脱峰II：纯化的rHu雷珠单抗，洗脱峰III：与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)；图4描述流穿模式多元层析I的层析谱(进料物质电导率：6.0mS/cm，平衡缓冲液：20.0mMTrispH9.0，使用5.0CV盐梯度洗脱的重折叠的rHu雷珠单抗)，流穿液：纯化的rHu雷珠单抗(29.69％纯度)；洗脱峰I：包括rHu雷珠单抗的方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，洗脱峰II：错误折叠和未折叠的雷珠单抗和方法相关的杂质；图5描述流穿模式多元层析I的层析谱(进料物质电导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于纯化来自重组宿主细胞的表达为包涵体或可溶形式的重组人源化(rHu)雷珠单抗的抗体片段的方法，所述方法包括：/n(a)溶解来自重组宿主细胞的含有rHu雷珠单抗的轻链和重链的包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；/n(b)重折叠步骤(a)的所述溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；/n(c)通过超滤浓缩步骤(b)的所述重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的重折叠的雷珠单抗；/n(d)将步骤(c)的所述浓缩的重折叠/可溶形式的rHu雷珠单抗进行多元层析，所述层析方法包括：/n(i)将具有范围为4.0至10.0的pH的步骤(c)的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mM TrisHCl和0mM至150mM NaCl或20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH；/n(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM氯化钠或20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM氯化钠，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH，/n其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；/n(iii)用缓冲液将来自步骤(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，所述来自步骤(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；/n(iv)用洗脱缓冲液洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；/n其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0.3％的聚集形式的rHu雷珠单抗。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170324 IN 2017110104101.一种用于纯化来自重组宿主细胞的表达为包涵体或可溶形式的重组人源化(rHu)雷珠单抗的抗体片段的方法，所述方法包括：
(a)溶解来自重组宿主细胞的含有rHu雷珠单抗的轻链和重链的包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；
(b)重折叠步骤(a)的所述溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；
(c)通过超滤浓缩步骤(b)的所述重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的重折叠的雷珠单抗；
(d)将步骤(c)的所述浓缩的重折叠/可溶形式的rHu雷珠单抗进行多元层析，所述层析方法包括：
(i)将具有范围为4.0至10.0的pH的步骤(c)的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mMTrisHCl和0mM至150mMNaCl或20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mMNaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH；
(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM氯化钠或20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM氯化钠，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH，
其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；
(iii)用缓冲液将来自步骤(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，所述来自步骤(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mMNaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
(iv)用洗脱缓冲液洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mMNaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0....

【专利技术属性】
技术研发人员：拉胡尔·沙拉德·布拉布姆，K·M·加尼，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：印度;IN