一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种基因重组大肠杆菌表达的融合蛋白制备方法，属于生物工程技术领域。针对目前各种大肠杆菌工程菌表达的融合蛋白制备工艺中的缺点，特别是菌体破胞这一步的难点，开发了一种适合工业化大生产的解决方案。其主要特征在于，发酵结束后，在不需要离心收集菌体的前提下，利用发酵液直接高温热破胞的方式达到高效的菌体破胞效果，再经过碟片离心机离心获得含有重组融合蛋白的上清液。然后利用膜过滤和膜浓缩常规流程获得浓缩后的重组融合蛋白溶液，然后经酶切获得目标多肽。该工艺设备要求低，工艺流程简单、成本低，非常适合工业化放大生产。

A method of preparing polypeptides by heat stable fusion protein

【技术实现步骤摘要】
一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法
本专利技术属于发酵工程领域，尤其涉及一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法。
技术介绍
利用大肠杆菌系统生产蛋白或多肽时，在提取过程中往往需要将菌体细胞破碎，把目标多肽释放出来，然后进一步提取。目前破胞的方法较多，比如超声法、高压均质、有机溶剂法、酶法、冻融法等，这些方法各自都存在一定的局限性，超声法破胞能耗较高不适于工业化放大生产，冻融法破胞需要的时间较长，高压均质破胞产生的热量较高容易对酶造成伤害，有机溶剂法缺点也非常明显，添加的有机溶剂会带来额外的环保压力，同时有机溶剂还可能对目标多肽带来伤害，而法破胞用的酶，破胞后释放出来的蛋白有可能会被其降解。现存的破胞方法在成本上或者规模上都不能达到最好的效果，所以急需寻找一种成本低又易于工业化生产的破胞提取方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种针对热稳定性蛋白的有效制备提取工艺。本专利技术的技术方案包括：一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法，它包括如下步骤：1)使用重组大肠杆菌发酵表达融合蛋白，该融合蛋白是热稳定蛋白与目标多肽的融合蛋白；2)将破胞缓冲液加热到60～100℃，与发酵液按质量比1∶(0.5～4)混合，同时加入相当于混合液质量0.01％-2％的表面活性剂，搅拌破胞；3)离心取上清；4)过滤除杂，超滤浓缩；5)酶切，得目标多肽；步骤1)所述热稳定蛋白是在60～100℃高温下维持稳定的蛋白，所述融合蛋白也能在60～100℃高温下维持稳定；步骤2)中，表面活性剂是非离子型表面活性剂；步骤2)中，所述破胞缓冲液能使破胞后混合溶液的pH值与融合蛋白等电点的差值的绝对值在2以上。优选地，步骤2)搅拌时间是5～60min。如前述的方法，其特征在于：步骤2)中的表面活性剂是聚醚类、聚乙二醇类、酯类或多元醇类非离子型表面活性剂，优选地，为曲拉通X-100或吐温-80。如前述的方法，其特征在于：步骤2)中的盐类缓冲液，所述的盐类选自磷酸盐、Tris-HCl、乙酸盐；和/或，浓度范围是10-100mM。如前述的方法，其特征在于：步骤3)所述离心为连续离心，优选地，为碟片式离心。如前述的方法，其特征在于：步骤3)中离心后的上清液中不溶物湿重不超过上清液的3％，优选地，不超过上清液的1％。如前述的方法，其特征在于：步骤4)中，过滤除杂使用PP材质的中空纤维膜或PES材质的微滤膜；和/或，超滤浓缩采用的膜是PES材质的。如前述的方法，其特征在于：步骤4)的超滤过程中，料液温度不超过40℃；和/或，压力不超过0.4MPa；和/或，pH值不超过8.5；优选地，步骤4)的超滤过程中，料液温度不超过35℃；和/或，压力补偿不超过0.2MPa；和/或，pH值不超过7.8。如前述的方法，其特征在于：步骤5)中的酶是肠激酶、胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶，优选地，为肠激酶。如前述的方法，其特征在于：步骤5)中反应在水相或者较低比例有机相体系中进行；所述有机相是乙腈或者短链醇类；所述短链指的是分子中碳原子个数不超过3；所述较低比例指比例不超过25％，优选地不超过10％，最优选地是低于5％。如前述的方法，步骤1)所述热稳定蛋白序列如SEQIDNO.1～3中任一所示；和/或，目标多肽的序列如SEQIDNO.36～43中任一所示；和/或，融合蛋白中，热稳定蛋白与目标多肽之间还有一段连接肽。优选地，融合蛋白的序列如SEQIDNO.4～35任一所示。如前述的方法，融合蛋白的序列如SEQIDNO.26所示。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的制备多肽的方法十分便利，设备要求低，破胞快速，成本低，所得蛋白收率高，活性高，非常适合大规模生产。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：高温破胞后的电泳图图2：融合蛋白(SEQIDNO.4)生产多肽P1结果HPLC图图3：融合蛋白(SEQIDNO.5)生产多肽P1结果HPLC图图4：融合蛋白(SEQIDNO.6)生产多肽P1结果HPLC图图5：融合蛋白(SEQIDNO.7)生产多肽P1结果HPLC图图6：融合蛋白(SEQIDNO.10)生产多肽P2结果HPLC图图7：融合蛋白(SEQIDNO.11)生产多肽P2结果HPLC图图8：融合蛋白(SEQIDNO.16)生产多肽P3结果HPLC图图9：融合蛋白(SEQIDNO.17)生产多肽P3结果HPLC图图10：融合蛋白(SEQIDNO.22)生产多肽P3结果HPLC图图11：融合蛋白(SEQIDNO.23)生产多肽P4结果HPLC图图12：融合蛋白(SEQIDNO.24)生产多肽P5结果HPLC图图13：融合蛋白(SEQIDNO.25)生产多肽P5结果HPLC图图14：融合蛋白(SEQIDNO.26)生产多肽P5结果HPLC图图15：融合蛋白(SEQIDNO.27)生产多肽P6结果HPLC图图16：融合蛋白(SEQIDNO.30)生产多肽P7结果HPLC图图17：融合蛋白(SEQIDNO.33)生产多肽P8结果HPLC图具体实施方式本专利技术大体涉及如下的步骤：1、重组大肠杆菌的发酵；2、重组大肠杆菌的高温破胞；3、离心分离；4、膜分离及膜浓缩；5、酶切。本专利技术具体的多肽制备方法包括：一级种培养条件：接种量：0.1％；培养温度37℃，摇床转速220rpm，培养7-9h，至OD600为3.0-7.0。所述一级种培养基组成：原料成分配比胰蛋白胨1％酵母提取物0.5％氯化钠1％二级种培养条件：接种量：0.1％；培养温度34℃，摇床转速220rpm，培养10-12h，至OD600为2.0-4.0。所述二级种培养基组成：原料成分配比磷酸氢二铵0.200％磷酸二氢钾0.675％一水柠檬酸0.093％七水硫酸镁0.070％Tracesolution0.25％...

【技术保护点】
1.一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，它包括如下步骤：/n1)使用重组大肠杆菌发酵表达融合蛋白，该融合蛋白是热稳定蛋白与目标多肽的融合蛋白；/n2)将破胞缓冲液加热到60～100℃，与发酵液按质量比1∶(0.5～4)混合，同时加入相当于混合液质量0.01％-2％的表面活性剂，搅拌破胞；/n3)离心取上清；/n4)过滤除杂，超滤浓缩；/n5)酶切，得目标多肽；/n步骤1)所述热稳定蛋白是在60～100℃高温下维持稳定的蛋白，所述融合蛋白也能在60～100℃高温下维持稳定；/n步骤2)中，表面活性剂是非离子型表面活性剂；/n步骤2)中，所述破胞缓冲液能使破胞后混合溶液的pH值与融合蛋白等电点的差值的绝对值在2以上。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)使用重组大肠杆菌发酵表达融合蛋白，该融合蛋白是热稳定蛋白与目标多肽的融合蛋白；
2)将破胞缓冲液加热到60～100℃，与发酵液按质量比1∶(0.5～4)混合，同时加入相当于混合液质量0.01％-2％的表面活性剂，搅拌破胞；
3)离心取上清；
4)过滤除杂，超滤浓缩；
5)酶切，得目标多肽；
步骤1)所述热稳定蛋白是在60～100℃高温下维持稳定的蛋白，所述融合蛋白也能在60～100℃高温下维持稳定；
步骤2)中，表面活性剂是非离子型表面活性剂；
步骤2)中，所述破胞缓冲液能使破胞后混合溶液的pH值与融合蛋白等电点的差值的绝对值在2以上。


2.如权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于：
步骤2)中的表面活性剂是聚醚类、聚乙二醇类、酯类或多元醇类非离子型表面活性剂，优选地，为曲拉通X-100或吐温-80。


3.如权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于：
步骤2)中的盐类缓冲液，所述的盐类选自磷酸盐、Tris-HCl、乙酸盐；和/或，浓度范围是10-100mM。


4.如权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于：
步骤3)所述离心为连续离心，优选地，为碟片式离心。


5.如权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于：
步骤3)中离心后的上清液中不溶物湿重不超过上清液的3％，优选地，不超过上清液的1％。


6.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘懿，
申请(专利权)人：成都英普博集生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51