抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用，所述单克隆中和抗体的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。本发明专利技术的抗原结合片段从成年中国猕猴体内获得，经人源化后对丝状病毒科的扎依尔型、苏丹型和马尔堡型三种假病毒均具有良好的中和活性，对GP蛋白具有较强的亲和力；所述单克隆中和抗体可潜在地应用于抗丝状病毒治疗药物研究、丝状病毒检测试剂盒研制以及丝状病毒抗原检测的分子生物学试剂等。

Monoclonal neutralizing antibody against filovirus and its preparation and Application

The invention provides an anti filovirus monoclonal neutralizing antibody and a preparation method and application thereof. The heavy chain variable region of the antigen binding fragment of the monoclonal neutralizing antibody includes an amino acid sequence as shown in SEQ ID No: 13 or SEQ ID No: 15; the light chain variable region of the antigen binding fragment includes an amino acid sequence as shown in SEQ ID No: 14 or SEQ ID No: 16. The antigen binding fragment of the invention is obtained from adult Chinese Macaca mulatta. After humanization, it has good neutralization activity to three kinds of Pseudoviruses of Filoviridae, namely Zaire, Sudan and Marburg, and has strong affinity to GP protein. The monoclonal neutralization antibody can be potentially applied to the research of anti filovirus therapeutic drugs and the development of filovirus detection kit And molecular biological reagents for the detection of filovirus antigens.

【技术实现步骤摘要】
抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
丝状病毒为单股负链RNA病毒，是感染包括人在内的灵长类动物的具有极高致死率的病原体，对感染后的灵长类会引起严重的出血热，主要分为埃博拉病毒属、马尔堡病毒属和奎瓦病毒属。其中，埃博拉病毒属包括扎依尔型(ZEBOV)、苏丹型(SUDV)、莱斯顿型(RESTV)、塔伊森林型(TAFV)和本迪布焦型(BDBV)5个种，埃博拉病毒的平均致死率约为50％，从感染埃博拉病毒至发病为止的潜伏期为2～21天，感染埃博拉病毒后，初期症状表现为疲劳发热、肌肉痛、头痛以及咽喉痛，继而出现呕吐、腹泻、发疹、肾功能以及肝功能受损、外出血等症状。目前国际上还未有特异性的上市治疗药物，因此对丝状病毒的诊断与治疗的研究显得尤其重要。GP蛋白是I型跨膜蛋白，由676个氨基酸残基组成，相对分子质量为150000-170000，是埃博拉病毒表面棘突的唯一结构蛋白，通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，在病毒入侵、胞膜融合等方面发挥重要的作用，同时GP蛋白能诱导产生中和抗体，是研制疫苗的重要靶点。国际上已经研制出三种抗体混合的药物ZMapp，但是治疗效果有限且不确切，且该抗体在临床I期缺乏有效性和安全性。CN105087497A公开了杂交瘤细胞株ZJEB8-01、抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体及其制备和应用，所述杂交瘤细胞株ZJEB8-01可用于分泌抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体与博拉病毒GP蛋白的第412-431位氨基酸序列抗原肽具有高的特异性和灵敏性，可应用于制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂。CN107541522A公开了抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用，所述抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2016106的杂交瘤细胞株所分泌的，所述单克隆抗体特异性强、生物结合活性好，与感染含GP基因的重组杆状病毒感染的sf9细胞发生反应，而不与正常的sf9细胞反应，可应用于制备检测埃博拉病毒GP蛋白的试剂盒和免疫分析上。然而，上述单克隆抗体对马尔堡病毒属和奎瓦病毒属不具有生物活性。因此，提供一种针对丝状病毒家族多个致病株的重组抗体，在丝状病毒的诊断与治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用，所述单克隆中和抗体基于猕猴实验技术平台制备得到，解决了丝状病毒抗体在实际诊断和治疗方面的问题，为建立丝状病毒检测、诊断、预防和治疗提供了新的方案。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种抗丝状病毒GP蛋白的抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:7所示的重链CDR3；所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQIDNO:4或如SEQIDNO:10所示的轻链CDR3；SEQIDNO:1所示的氨基酸序列为：TRGGSDNHRYFYY；SEQIDNO:4所示的氨基酸序列为：GECHTIDGQDGCL；SEQIDNO:7所示的氨基酸序列为：ARDHSTYYYGNGFSS；SEQIDNO:10所示的氨基酸序列为：LQAYSVPYS.优选地，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQIDNO:2或如SEQIDNO:8所示的重链CDR2，如SEQIDNO:3或如SEQIDNO:9所示的重链CDR1；优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQIDNO:5或如SEQIDNO:11所示的轻链CDR2，如SEQIDNO:6或如SEQIDNO:12所示的轻链CDR1；SEQIDNO:2所示的氨基酸序列为：IFGSAM；SEQIDNO:3所示的氨基酸序列为：GFTVSSYW；SEQIDNO:5所示的氨基酸序列为：VNSDGTQ；SEQIDNO:6所示的氨基酸序列为：SEHSNYF；SEQIDNO:8所示的氨基酸序列为：ISSDGSKK；SEQIDNO:9所示的氨基酸序列为：GFTFSNFG；SEQIDNO:11所示的氨基酸序列为：ATS；SEQIDNO:12所示的氨基酸序列为：QIISDH.优选地，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQIDNO:13或如SEQIDNO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQIDNO:14或如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列；SEQIDNO:13所示的氨基酸序列为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYWMSWVRQAPGKGLEWLSDIFGSAMYYGDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGGSDNHRYFYYWGQGVLVTVSS；SEQIDNO:14所示的氨基酸序列为：QSVLTQPPSASASLGASVKLTCTLSSEHSNYFIIWYQQRPGRSPRYIMKVNSDGTQNKGDGIPDRFLGSSSGADRYLTISNLQSDDEAEYYCGECHTIDGQDGCLFGGGTRLTVL；SEQIDNO:15所示的氨基酸序列为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGLHWVRQAPGKGLDWVAVISSDGSKKYYVDSVQHRFTISRDDSKNILYLQMNNLKLEDTAVYYCARDHSTYYYGNGFSSWGQGVLVTVSS；SEQIDNO:16所示的氨基酸序列为：DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIISDHLSWYQQKPGKAPKLLIYATSNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLASYYCLQAYSVPYSFGQGTKVEIK.本专利技术中，选择成年中国猕猴作为实验动物，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，得到的单克隆中和抗体与人基因的同源性高。第二方面，本专利技术提供了一种单克隆中和抗体，所述单克隆中和抗体包括：重链可变区，所述重链可变区包括如SEQIDNO:13或如SEQIDNO:15所示的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQIDNO:14或如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列。本专利技术中，SEQIDNO:13所示的抗体重链与SEQIDNO:14所示的抗体轻链配对产生单克隆中和抗体7D10，SEQIDNO:15所示的抗体重链与SEQIDNO:16所示的抗体轻链配对产生单克隆中和抗体7E10。优选地，所述单克隆中和抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。本专利技术中，通过同源重组将可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，实现了抗体的人源化。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗丝状病毒GP蛋白的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:7所示的重链CDR3；/n所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:10所示的轻链CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗丝状病毒GP蛋白的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:7所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQIDNO:4或如SEQIDNO:10所示的轻链CDR3。


2.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQIDNO:2或如SEQIDNO:8所示的重链CDR2，如SEQIDNO:3或如SEQIDNO:9所示的重链CDR1；
优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQIDNO:5或如SEQIDNO:11所示的轻链CDR2，如SEQIDNO:6或如SEQIDNO:12所示的轻链CDR1。


3.根据权利要求1或2所述的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQIDNO:13或如SEQIDNO:15所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQIDNO:14或如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列。


4.一种单克隆中和抗体，其特征在于，所述单克隆中和抗体包括：
重链可变区，所述重链可变区包括如SEQIDNO:13或如SEQIDNO:15所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQIDNO:14或如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列；
优选地，所述单克隆中和抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。


5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段和/或如权利要求4所述的单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA片段；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，冯玉鹏，冯立强，王龙雨，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44