利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，包括步骤：一、在取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA并反转录合成cDNA；二、对任一四角蛤蜊样品的DMRT基因和GAPDH基因进行扩增并绘制溶解曲线；三、检测SYBRGreen在PCR反应过程中荧光信号的变化得到每个PCR反应的Ct值，以GAPDH基因为内参，采用2

Detection of PBDEs in the sea by DMRT gene of Mactra tetragona

The invention discloses a method for detecting PBDEs in the sea by DMRT gene of clam tetrapod, which comprises the following steps: 1. Taking adult male clam tetrapod at the sampling point, extracting gonad RNA and reverse transcribing to synthesize cDNA; 2. Amplifying DMRT gene and GAPDH Gene of any clam sample and drawing dissolution curve; 3. Detecting the change of fluorescence signal of SYBRGREEN during PCR reaction To the CT value of each PCR reaction, take GAPDH Gene as internal reference, and use 2

【技术实现步骤摘要】
利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法
本专利技术涉及一种检测多溴联苯醚（PBDEs）的方法，具体涉及一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，属于海洋PBDEs生物检测

技术介绍
多溴联苯醚（polybrominateddiphenylethers，PBDEs）是一系列含溴原子的芳香族化合物。作为全球使用最广泛的溴代阻燃剂，PBDEs在电子电器、纺织、橡胶、塑料、化工等领域得到了大量应用。PBDEs能够通过生产、使用和产品的废弃而进入到环境中，通过大气沉降、地表径流等形式汇聚于海洋，累积于海洋沉积物和生物体中。PBDEs污染遍布我国沿海，在渤海湾、辽东湾、莱州湾、胶州湾、厦门海域和珠江口海域，均检测到了PBDEs污染，在溴代阻燃剂生产工厂分布密集的莱州湾，4-6cm海洋沉积物中PBDEs浓度高达1800ng·g-1干重，贝类PBDEs富集量为230-720ng/g脂肪，高于日本（6.2-49ng/g脂肪）、韩国（8.5-440ng/g脂肪）和菲律宾（69-140ng/g脂肪），是目前报道的全球海域中贝类富集量的最高水平。毒理学实验表明，PBDEs对生物体具有内分泌干扰、免疫、发育、神经等多种毒性。目前，PBDEs的检测需借助大型仪器，例如：气相色谱-质谱联用。为了获得较为准确的结果，还需要配备专业的操作人员、选用C同位素内标，检测步骤繁琐、成本高。在前处理过程中会使用大量有机试剂，测定过程中还要使用标准品，造成了环境的二次污染。另外，方法和仪器都具有检测限，低于检测限的浓度检测不出来。关键的是，检测出的数值不能反映PBDEs对生物体的影响。众所周知，污染物对生物体的影响是从分子水平开始的，然后逐步在细胞、组织、器官、个体、种群、群落等水平上显现。生物标志物是环境变化的生物学指标，可在生物体受到严重损伤之前提供早期预警，是监测环境生物效应的有效手段。尤其是分子水平的生物标志物，较细胞、组织、器官、个体和群落水平可以提供更为早期的预警，以便进行环境调控，避免大规模损失。生物标志物监测在国际上应用广泛，是发达国家海洋环境管理策略（如欧盟海洋战略框架指令）的强制性指标。我国海洋生态环境的生物监测，主要是利用海洋生物群落多样性评估生态环境质量，而群落多样性对于生态环境的响应较分子水平的生物标志物滞后。贝类由于具有特殊的生活习性，并且分布广泛，是海洋环境污染的良好指示生物，也是毒理学研究的有力工具。贝类监测计划在世界范围内广泛开展。《中国海洋生态环境状况公报》通过检测贝类体内污染物的富集量来反映生态环境状况。目前，暂时还没有从环境导致的生物效应角度评估环境状况。贝类的生物监测多集中于附着型贝类——贻贝和牡蛎。然而在缺乏附着基的滩涂区域，贻贝和牡蛎的分布量非常小，并且贻贝和牡蛎不能对海洋沉积物的污染做出有效指示。滩涂是海洋环境中受人类活动影响最为严重的区域，我国滩涂面积广阔，随着滩涂生态与环境状况恶化，开发滩涂贝类用于环境检测和毒理学研究是十分必要的。四角蛤蜊（Mactraveneriformis）是一种典型的滩涂贝类，广泛分布在我国、韩国和日本沿海，是我国主要的经济贝类之一。四角蛤蜊能够大量富集污染物，具有作为污染物指示物种的潜力，其埋栖生活的特性，对海洋沉积物和水质污染有较好的指示作用。DMRT（double-sexandmab-3relatatedtranscriptionfactor）基因是一类转录调控因子，在性别决定、性腺分化、组织和器官的发育形成和功能维持等发面发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs的方法。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR反应的Ct值，然后以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT法对结果进行分析，计算出DMRT基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下反应体系进行扩增：cDNA1μL、实时定量PCR反应混合液10μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、水8.2μL；其中，用于检测四角蛤蜊DMRT基因的引物的序列信息如下：正向引物DF：GTTCTGCTGCGGACAGGTAT反向引物DR：TAAGACGCCCATCTCACG用于检测四角蛤蜊GAPDH基因的引物的序列信息如下：正向引物GF：CGTATTGGTCGTCTTGTTGTTAG反向引物GR：TTAGCAGGGTCTTTCTCGTTAT。前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下PCR条件进行扩增：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，PCR扩增使用的试剂盒是SYBRGreenQRT-PCR试剂盒。前述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，扩增结束后，对部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、测序以验证扩增的特异性和准确性。本专利技术的有益之处在于：（1）利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中的PBDEs，相比于目前的仪器化学方法，检出限更低，方法更加灵敏；（2）采用的监测生物——四角蛤蜊在我国沿海分布广泛，采样便利；（3）整个检测过程不使用有机试剂和污染物标准品，减少了对环境的污染，更为环保；（4）检测成本更低，检测时间更短，重复性好，可信度高；（5）对操作人员的专业性要求低，安全保障高；（6）测定的数据不仅能够反映海水和海洋沉积物被PBDEs污染的状况，还能体现污染的生物学效应；（7）利用早期的分子水平的生物标志物，能够实现海洋环境PBDEs污染的更早期预警，克服了传统的从群落水平进行海洋环境生物监测的滞后性。附图说明图1是实施例1中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果；图2是实施例2中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果；图3是实施例3中的四角蛤蜊DMRT基因表达量的计算结果。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；/n步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；/n步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR 反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR 反应的Ct 值，然后以GAPDH基因为内参，采用2

【技术特征摘要】
1.利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：在待测海水或海洋沉积物的取样点取雄性四角蛤蜊成体，提取性腺RNA，以该性腺RNA为模板反转录合成cDNA；
步骤二：对于任意一个四角蛤蜊样品，对其DMRT基因和GAPDH基因进行扩增，并绘制溶解曲线，DMRT基因和GAPDH基因分别扩增时，加入等量的cDNA模板；
步骤三：通过检测SYBRGreen在PCR反应过程中荧光信号的变化，得到每个PCR反应的Ct值，然后以GAPDH基因为内参，采用2−△△CT法对结果进行分析，计算出DMRT基因的相对表达量，DMRT基因的相对表达量与PBDEs的浓度呈现显著负相关，测定DMRT基因的相对表达量就可以反映海水或海洋沉积物被PBDEs污染的状况。


2.根据权利要求1所述的利用四角蛤蜊DMRT基因检测海洋中PBDEs的方法，其特征在于，在步骤二中，按照如下反应体系进行扩增：
cDNA1μL、实时定量PCR反应混合液10μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、水8.2μL；
其中，用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：房燕，梁欢，柳茂生，王一奇，姚蕾，邹强，王维忠，付建革，柯可，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37