一种用于基因定点突变的核酸构建物制造技术

本发明专利技术提供了一种用于基因定点突变的核酸构建物，具体地，本发明专利技术涉及一种核酸构建物，本发明专利技术采用特定结构的核酸构建物，首次在植物中成功实现了sgRNA引导的高效的碱基定点突变(如C突变为T或由G突变为A)。

A nucleic acid construct for site directed gene mutation

The invention provides a nucleic acid structure for site directed gene mutation, in particular, the invention relates to a nucleic acid structure, the invention adopts a specific structure of nucleic acid structure, and successfully realizes sgRNA guided efficient site directed gene mutation in plants for the first time (for example, C mutation is t or G mutation is a).

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因定点突变的核酸构建物
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种用于基因定点突变的核酸构建物。
技术介绍
植物中许多性状的差异由一个或几个DNA碱基的变异造成，突变某些特定碱基可增强、减弱或抑制其某个性状的表达。CRISPR-Cas9基因编辑技术已经广泛应用于动植物基因编辑的研究中，目前主要包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，碱基编辑器能够在基因组中进行精确的碱基替换，且不会造成DNA双链断裂(DSB)。早期开发的CBE和ABE系统，分别由大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1来源于七鳃鳗的胞苷脱氨酶PmCDA1和由tRNA腺嘌呤脱氨酶进化来的TadA组成，已应用于许多植物物种中，如水稻，小麦，玉米，番茄，拟南芥和甘蓝型油菜。为了进一步提高植物的碱基编辑效率，Kang等人对启动子进行了优化，Zong等人对脱氨酶进行了优化。另一方面，为了扩大基因编辑范围，Qin等和Hua等人利用了不同于SpCas9的其它Cas9蛋白，这些Cas9蛋白的变体可识别与经典NGG基序不一样的PAM序列。然而，相对于目前广泛使用的基因敲除技术，单碱基编辑的效率仍然很低。此外，至今报道的碱基编辑器仅能识别有限的几种PAM序列，使得植物基因组中可编辑的范围受到很大的限制。因此，本领域迫切需要开发一种在植物细胞中可高效、可在较大范围内且精确地实现C-T转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在植物细胞中可高效、可在较大范围且精确地实现C-T转化同时显著降低插入或缺失突变风险的新的用于基因编辑的核酸构建物。本专利技术第一方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：I1-Z1-Z2-I2(I)式中，I1为第一整合元件；I2为第二整合元件；Z1为第一表达盒；Z2为第二表达盒；并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有Ia结构，而另一个表达盒具有式Ib结构：P1-S1-X1-L1-X2-X4-L2-X3(Ia)P2-Y1(Ib)；式中，P1、S1、X1、L1、X2、X4、L2、X3、P2、Y1分别为用于构成所述构建物的元件；P1为第一启动子，所述第一启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子；S1为第一核定位信号的编码序列；X1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列；L1为无或第一连接肽的编码序列；X2为Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；X4为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列；L2为无或第二连接肽的编码序列；X3为第二核定位信号的编码序列；P2为第二启动子；Y1为sgRNA的编码序列；并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种植物：玉米、水稻、大豆、拟南芥或番茄。在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种微生物：链霉菌、大肠杆菌。在另一优选例中，所述第一启动子来源于选自下组的一种或多种病毒：烟草花叶病毒、黄叶卷曲病毒、花椰菜花叶病毒、棉花曲叶病毒。在另一优选例中，所述第一启动子包括玉米泛素启动子。在另一优选例中，所述泛素启动子包括UBI启动子。在另一优选例中，所述第一启动子选自下组：UBI、UBQ、35S、Actin、SPL，CmYLCV、YAO、CDC45、rbcS、rbcL、PsGNS2、UEP1、TobRB7、Cab、或其组合。在另一优选例中，所述的L1和L2的核苷酸序列长度各自独立地为3-120nt,较佳的为3-96nt，并且优选为3的倍数。在另一优选例中，所述的L1和L2编码的氨基酸序列长度各自独立的为3-40aa，较佳的为6-32aa，较佳的为18-32aa，较佳的为24-32aa。在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列长度为1-300nt，较佳地1-100nt。在另一优选例中，所述核苷酸连接序列不影响各元件的正常转录和翻译。在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9n、Cas9NG、或其组合。在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、SqCas9n、XCas9n、或其组合。在另一优选例中，所述Cas9核酸酶包括突变的Cas9核酸酶。在另一优选例中，所述的Cas9核酸酶与所述的突变的Cas9核酸酶的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％。在另一优选例中，所述的突变Cas9核酸酶与野生型Cas9酶的活性相当或显著优于野生型Cas9酶的活性。在另一优选例中，所述突变的Cas9核酸酶由所述的野生型的Cas9核酸酶经过一个或多个，较佳地1-15个，较佳地1-10个，较佳的1-7个，更佳地2-5个，氨基酸取代、缺失；和/或经过1-5，较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个氨基酸的添加形成的。在另一优选例中，所述X2元件中，突变位点在Cas9核酸酶(SEQIDNO.:2)的D10A位：MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：/nI1-Z1-Z2-I2 (I)/n式中，/nI1为第一整合元件；/nI2为第二整合元件；/nZ1为第一表达盒；/nZ2为第二表达盒；/n并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有Ia结构，而另一个表达盒具有式Ib结构：/nP1-S1-X1-L1-X2-X4-L2-X3 (Ia)/nP2-Y1 (Ib)；/n式中，/nP1、S1、X1、L1、X2、X4、L2、X3、P2、Y1分别为用于构成所述构建物的元件；/nP1为第一启动子，所述第一启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子；/nS1为核定位信号的编码序列；/nX1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列；/nL1为无或第一连接肽的编码序列；/nX2为Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；/nX4为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列；/nL2为无或第二连接肽的编码序列；/nX3为核定位信号的编码序列；/nP2为第二启动子；/nY1为sgRNA的编码序列；/n并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。/n

【技术特征摘要】
20190307 CN 20191017314881.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：
I1-Z1-Z2-I2(I)
式中，
I1为第一整合元件；
I2为第二整合元件；
Z1为第一表达盒；
Z2为第二表达盒；
并且，Z1和Z2中的一个表达盒具有Ia结构，而另一个表达盒具有式Ib结构：
P1-S1-X1-L1-X2-X4-L2-X3(Ia)
P2-Y1(Ib)；
式中，
P1、S1、X1、L1、X2、X4、L2、X3、P2、Y1分别为用于构成所述构建物的元件；
P1为第一启动子，所述第一启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子；
S1为核定位信号的编码序列；
X1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列；
L1为无或第一连接肽的编码序列；
X2为Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；
X4为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列；
L2为无或第二连接肽的编码序列；
X3为核定位信号的编码序列；
P2为第二启动子；
Y1为sgRNA的编码序列；
并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。


2.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括胞嘧啶脱氨酶和Cas9核酸酶，并且所述融合蛋白由权利要求1所述的核酸构建物编码。


3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核酸构建物。


4.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1所述的核酸构建物，或其基因组整合有一个或多个权利要求1所述的核酸构建物。


5.一种用于基因编辑的试剂组合，其特征在于，包括：
(i)第一核酸构建物，或含有所述第一核酸构建物的第一载体，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式Ia结构：
P1-S1-X1-L1-X2-X4-L2-X3(Ia)...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37