The invention discloses a creation method of heavy metal super enrichment transgenic engineering rape with twin genes of sphma 2 and sphma 3, which includes cloning the twin genes of sphma 2 and sphma 3 in Jingtian, constructing a transformation vector containing strong promoter and screening gene based on the plant expression vector, connecting the gene of sphma 3 to the enzyme cutting site of the transformation vector through the double enzyme cutting method, and connecting the gene of sphma 3 to the enzyme cutting site of the transformation vector Through inserting the gene of phma2 into the transformation vector, a dual gene over expression dual vector is obtained; the dual gene over expression dual vector is transferred into the hypocotyl section of rape through agrobacterium tumefaciens, and the transgenic seedlings are cultivated and the transgenic positive plants polymerized and expressed by the dual genes are screened. The cultivation method can solve the problems of limited tolerance, slow growth, small biomass, special growth environment and heavy metal return of wild heavy metal enrichment plants. In addition, the invention also provides the application of the heavy metal super enrichment transgenic double gene plant in the soil heavy metal restoration.
【技术实现步骤摘要】
转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用
本专利技术属于转基因植株和重金属污染治理领域，具体涉及转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法及应用。
技术介绍
重金属污染问题已成为一个世界性重大环境问题，重金属污染不仅威胁动植物、微生物生产发育，还通过食物链等威胁人类健康乃至生命。导致土壤污染的重金属主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg等，一般为几种重金属的复合污染。重金属矿区、经济高速发展区的重金属污染情况尤为严重，导致我国许多农产品由于重金属超标而被拒绝进入国际市场。各国对重金属污染的生态效应和防治的研究越来越重视，已探索出多种治理技术。然而传统的重金属污染技术如土壤固化、玻璃化、淋滤化、洗土法、客土法、电化学法等物理化学方法，不仅成本高昂，难以大规模使用，而且常常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，寻求一种廉价而永久有效，又可以维持土壤肥力的替换方法一直是国际上研究的难点和热点。利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环境友好和可再利用等特点，是一种非常有前景的环境污染原位治理途径。广义的植物修复指通过植物萃取、转化、固定、挥发、降解作用将土壤及水体中有机污染物、重金属等污染物清除的过程。通过种植具有重金属富集能力的植物，将植物收割并妥善处理(如灰化等)，以到达将重金属移出土壤环境，清除土壤重金属污染的目的。基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，重金属富集...
【技术保护点】
1.一种转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)重金属超富集基因的克隆/n分别克隆伴矿景天中SpHMA2和SpHMA3基因；/n(2)超量表达双元载体的构建/n以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将步骤(1)克隆得到的SpHMA3基因通过双酶切法连接到所述转化载体得到中间转化载体，再将克隆得到的SpHMA2基因通过同源重组方法插入到中间转化载体，获得双基因超量表达双元载体；/n(3)重金属超富集转基因植株构建/n将步骤(2)所得的双基因超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性油菜下胚轴切段经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选获得双基因聚合表达的转基因阳性植株；/n其中，所述SpHMA2基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重金属超富集SpHMA3基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述油菜品种为甘蓝型油菜K407。/n
【技术特征摘要】
1.一种转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)重金属超富集基因的克隆
分别克隆伴矿景天中SpHMA2和SpHMA3基因；
(2)超量表达双元载体的构建
以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将步骤(1)克隆得到的SpHMA3基因通过双酶切法连接到所述转化载体得到中间转化载体，再将克隆得到的SpHMA2基因通过同源重组方法插入到中间转化载体，获得双基因超量表达双元载体；
(3)重金属超富集转基因植株构建
将步骤(2)所得的双基因超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性油菜下胚轴切段经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选获得双基因聚合表达的转基因阳性植株；
其中，所述SpHMA2基因核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述重金属超富集SpHMA3基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述油菜品种为甘蓝型油菜K407。
2.如权利要求1所述的转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，其特征在于：所述步骤(1)中，克隆伴矿景天中SpHMA2和SpHMA3双基因的方法为：
以伴矿景天的cDNA为模板，以如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到SpHMA2基因；以如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到SpHMA3基因。
3.如权利要求1所述的转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，其特征在于：所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为2×CaMV35S启动子，所述筛选基因为Hyg筛选基因。
4.如权利要求3所述的转伴矿景天SpHMA2和SpHMA3双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，其特征在于：所述转化载体的构建方法包括以下步骤：
(a)采用HindⅢ和BamHI酶切pCAMBIA1301载体上的CaMV35S启动子，使用1％的琼脂糖进行电泳，回收小条带；
(b)使用35S-F/R以上一步回收产物为模板进行PCR，回收1000bp左右的条带，使用HindⅢ和BamHI酶切回收产物及pCAMBIA1301载体，并回收酶切产物；
(c)将上述酶切片段和酶切载体的回收产物使用T4连接酶进行连接；
(d)所得载体为pCAMBIA1301-2×35S，即转化所用载体；
(e)使用BglⅡ和BstEⅡ酶切pCAMBIA1301-2×35S载体；
(f)以SpHMA3-F...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜鹰，陈坤明，袁博，刘佳兰，李永辉，白帆，魏伟，刘捷，
申请(专利权)人：广东开源环境科技有限公司，西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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