独立于DNA双链断裂的靶向基因编辑平台及其用途制造技术

本发明专利技术公开了用于靶向基因编辑的系统及相关用途。

Target gene editing platform independent of DNA double strand breaks and its application

The invention discloses a system for target gene editing and related uses.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】独立于DNA双链断裂的靶向基因编辑平台及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2017年1月5日提交的美国临时申请号62/442,704的优先权。该申请的内容通过引用整体并入本文。政府利益本文所公开的专利技术至少部分是在美国国务院富布赖特外国学生计划的资助号15130816的政府支持下完成的。因此，美国政府对本专利技术具有一定的权利。专利
本专利技术涉及用于靶向基因编辑的系统及相关用途。专利技术背景靶向基因编辑是真核细胞、胚胎和动物遗传操作的有力工具。使用它，靶向的基因组位置和/或特定的染色体序列可以被缺失、失活或修饰。目前的几种方法依赖于使用工程化的核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)。这些嵌合核酸酶含有与非特异性DNA切割结构域连接的可编程的、序列特异性DNA结合模块。由于每个新的基因组靶均需要设计包含新的序列特异性DNA结合模块的新的ZFN或TALEN，这些定制设计的核酸酶制备起来往往是昂贵且耗时的。而且，ZFN和TALEN的特异性使得它们能够介导脱靶(off-target)切割。最近开发的基因组修饰技术利用细菌成簇规律间隔短回文重复序列(clustersofregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)相关蛋白9(Cas9)(一种RNA指导的DNA内切核酸酶)诱导DNA靶位点上特定的双链断裂(DSB)。RNA-Cas9复合物识别其同源DNA靶序列并与其碱基配对，导致靶切割形成DSB。<br>然而，一个尚未解决的主要问题是如何校正体细胞中的基因突变。目前现有技术的共同效应子是核酸酶，所述核酸酶导致DNADSB，其进而触发细胞通路的激活，如同源重组和非同源末端连接。这个过程有许多严重缺点。首先，由于末端连接的最终产品具有不可预知的性质，DSB以随机和不可预测的方式导致框内(in-frame)和移框(frame-shift)突变，这限制了其用于直接临床应用。其次，DSB可能引起非局部致突变事件，如染色体易位，这是该过程的不良后果。在体内，这些变化可能是潜在有害的。第三，修复或校正通常需要DSB介导的同源重组，其活性在治疗剂尤为重要的大多数体细胞组织/细胞中低或甚至不存在。因此，目前基于DSB核酸酶的技术对基因编辑的适用性有限，并且存在对不依赖于导致双链断裂的核酸酶活性的靶向基因修饰技术的需求。专利技术概述本专利技术通过提供靶向基因编辑系统和相关用途来解决上述需求。本专利技术一方面提供了靶核酸或多核苷酸(例如，DNA或RNA)的位点特异性修饰的方法。该方法包括将基因编辑系统导入靶核酸。基因编辑系统包含识别靶核酸或多核苷酸(例如，DNA或RNA)的两种不同特定核酸序列的第一系统和第二系统。(参见，例如，图1A中的图示)。第一系统包含(i)第一序列靶向的单链DNA(ssDNA)切口蛋白(STP)，(ii)第一RNA支架，其包含：(a)第一核酸靶向基序，其包含与靶DNA中的第一靶核酸序列互补的第一指导RNA序列，(b)能够结合第一序列靶向蛋白的第一CRISPR基序，和(c)第一募集RNA基序，和(iii)第一非核酸酶效应子融合蛋白，其包含：(a)能够结合第一募集RNA基序的第一RNA结合结构域，(b)第一接头，和(c)第一效应子结构域。第一非核酸酶效应子融合蛋白具有酶活性。第二系统识别靶DNA中的第二特定核酸序列。第一靶核酸序列和第二靶核酸序列在靶DNA的同一条链上。两个靶核酸序列中的任一个可以在另一个的上游或下游，使得第一和第二系统识别围绕靶核苷酸的两个特定序列(例如，由gRNA指导)(例如，一个gRNA在靶位点上游，一个在靶位点的下游)，以顺式(即在相同的DNA链上)引入彼此接近的两个缺口。通过这种方式，瞬时暴露一段ssDNA，允许效应子模块(例如，下文描述的CRC效应子模块)催化核苷酸转换，然后在链修复时固定引入的修饰(参见，例如图8B和图10A-D)。第二系统可以具有各种组分组，但通常具有(i)第二序列靶向的ssDNA切口蛋白，用于靶向靶DNA中的第二靶核酸序列。该序列靶向的ssDNA切口蛋白可以与第一系统中的序列靶向的ssDNA切口蛋白相同。在一个实施方案中，第二系统进一步包含(ii)第二RNA支架，其包含：(a)第二核酸靶向基序，其包含与靶DNA中的第二靶核酸序列互补的第二指导RNA序列，(b)能够结合第二序列靶向蛋白的第二CRISPR基序，和(c)第二募集RNA基序，和(iii)第二非核酸酶效应子融合蛋白，其包含：(a)能够结合第二募集RNA基序的第二RNA结合结构域，(b)第二接头，和(c)第二效应子结构域。(ii)中的第二募集RNA基序和(iii)中的所有组分可以与第一个系统的组分相同或不同。第二效应子融合蛋白可具有或不具有酶活性。在另一个实施方案中，第二系统可以进一步包含(ii)第二RNA支架，其包含(a)第二核酸靶向基序，其包含与靶DNA中的第二靶核酸序列互补的第二指导RNA序列和(b)能够结合第二序列靶向蛋白的第二CRISPR基序。优选地，第二RNA支架不具有募集RNA基序，使得没有效应子蛋白募集至第二靶核酸序列。在另一个实施方案中，第二系统可以进一步包含(ii)第二RNA支架，其包含：(a)第二核酸靶向基序，其包含与靶DNA中的第二靶核酸序列互补的第二指导RNA序列，(b)能够结合第二序列靶向蛋白的第二CRISPR基序，和(c)第二募集RNA基序，和(iii)局部DNA修复抑制剂融合蛋白，其包含：(a)能够结合第二募集RNA基序的第二RNA结合结构域，(b)第二接头，和(c)局部DNA修复抑制剂结构域。在上述方法中，第一或第二序列靶向蛋白可以是CRISPR蛋白。优选地，第一或第二序列靶向蛋白不具有产生双链断裂的核酸酶活性。第一或第二序列靶向蛋白的实例包括选自由以下组成的组的物种的dCas9或nCas9(切口酶Cas9)的序列：化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)和齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)。在一些实施方案中，第一序列靶向蛋白和第二序列靶向蛋白可以是直系同源物并且结合不同的PAM。在上述方法中，(i)第一募集RNA基序和第一RNA结合结构域或(ii)第二募集RNA基序和第二RNA结合结构域可以是选自由以下组成的组的对：端粒酶Ku结合基序和Ku蛋白或其RNA结合部分、端粒酶Sm7结合基序和Sm7蛋白或其RNA结合部分、MS2噬菌体操纵子茎环和MS2外壳蛋白(MCP)或其RNA结合部分、PP7噬菌体操纵子茎环和PP7外壳蛋白(PCP)或其RNA结合部分、SfMu噬菌体Com茎环和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过基因编辑系统对靶DNA或RNA进行位点特异性修饰的方法，其包含分别在靶DNA或RNA中将第一系统和第二系统与第一靶核酸序列和第二靶核酸序列相互作用；其中/n(1)第一系统包含：/n(i)第一序列靶向蛋白，/n(ii)第一RNA支架，其包含：(a)第一核酸靶向基序，其包含与靶DNA或RNA中第一靶核酸序列互补的第一指导RNA序列，(b)能够结合第一序列靶向蛋白的第一CRISPR基序，和(c)第一募集RNA基序，和/n(iii)第一非核酸酶效应子融合蛋白，其包含：(a)能够结合第一募集RNA基序的第一RNA结合结构域，(b)第一接头，和(c)第一效应子结构域，/n其中第一非核酸酶效应子融合蛋白具有酶活性；且/n(2)第二系统包含：/n(i)第二序列靶向蛋白和/n(ii)第二RNA支架，其包含：(a)第二核酸靶向基序，其包含与靶DNA或RNA中第二靶核酸序列互补的第二指导RNA序列，和(b)能够结合第二序列靶向蛋白的第二CRISPR基序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170105 US 62/442,7041.一种通过基因编辑系统对靶DNA或RNA进行位点特异性修饰的方法，其包含分别在靶DNA或RNA中将第一系统和第二系统与第一靶核酸序列和第二靶核酸序列相互作用；其中
(1)第一系统包含：
(i)第一序列靶向蛋白，
(ii)第一RNA支架，其包含：(a)第一核酸靶向基序，其包含与靶DNA或RNA中第一靶核酸序列互补的第一指导RNA序列，(b)能够结合第一序列靶向蛋白的第一CRISPR基序，和(c)第一募集RNA基序，和
(iii)第一非核酸酶效应子融合蛋白，其包含：(a)能够结合第一募集RNA基序的第一RNA结合结构域，(b)第一接头，和(c)第一效应子结构域，
其中第一非核酸酶效应子融合蛋白具有酶活性；且
(2)第二系统包含：
(i)第二序列靶向蛋白和
(ii)第二RNA支架，其包含：(a)第二核酸靶向基序，其包含与靶DNA或RNA中第二靶核酸序列互补的第二指导RNA序列，和(b)能够结合第二序列靶向蛋白的第二CRISPR基序。


2.根据权利要求1所述的方法，其中第二RNA支架进一步包含(c)第二募集RNA基序。


3.根据权利要求2所述的方法，其中第二系统进一步包含
(iii)第二非核酸酶效应子融合蛋白，其包含：(a)能够结合第二募集RNA基序的第二RNA结合结构域，(b)第二接头，和(c)第二效应子结构域，
其中第二非核酸酶效应子融合蛋白可具有或不具有酶活性。


4.根据权利要求2所述的方法，其中第二系统包含：(iii)局部DNA修复抑制剂融合蛋白，其包含：(a)能够结合第二募集RNA基序的第二RNA结合结构域，(b)第二接头，和(c)局部DNA修复抑制剂结构域。


5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中第一或第二序列靶向蛋白是不引起双链DNA断裂的CRISPR蛋白变体。


6.根据权利要求1至5任一项所述的系统，其中第一或第二序列靶向蛋白不具有引起双链DNA断裂的核酸酶活性。


7.根据权利要求1至6任一项所述的系统，其中第一或第二序列靶向蛋白包含选自由以下组成的组的物种的dCas9或nCas9的序列：化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)和齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)。


8.根据权利要求7所述的方法，其中第一序列靶向蛋白和第二序列靶向蛋白是Cas9的直系同源物和变体并且结合不同的PAM。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中第一或第二募集RNA基序和第一或第二RNA结合结构域是选自由以下组成的组的对：
端粒酶Ku结合基序和Ku蛋白或其RNA结合部分，
端粒酶Sm7结合基序和Sm7蛋白或其RNA结合部分，
MS2噬菌体操纵子茎环和MS2外壳蛋白(MCP)或其RNA结合部分，
PP7噬菌体操纵子茎环和PP7外壳蛋白(PCP)或其RNA结合部分，
SfMu噬...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晟侃，JC·科兰特斯，
申请(专利权)人：新泽西鲁特格斯州立大学，
类型：发明
国别省市：美国;US