具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法技术

本公开提供了具有改变的衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，所述重组AAV(rAAV)病毒体表现出更大的跨越在玻璃体内流体与视网膜细胞之间的屏障的能力，并因此具有更大的视网膜细胞感染性，并且其中rAAV病毒体包含异源核酸。本公开提供了将基因产物递送到个体中的视网膜细胞的方法。

Adeno-associated virus with variant capsid and its application

The present disclosure provides recombinant adeno-associated virus (AAV) virus bodies with altered capsid proteins, wherein the recombinant AAV (rAAV) virus bodies exhibit a greater ability to cross the barrier between the fluid in the vitreous body and the retinal cells, and thus have greater retinal cell infectivity, and wherein the rAAV virus bodies contain heterologous nucleic acids. The present disclosure provides a method for delivering gene products to retinal cells in an individual.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法交叉引用本申请要求2017年6月30日提交的美国临时专利申请号62/527,871和2017年7月20日提交的美国临时专利申请号62/535,042的权益，这些申请的全部内容以引用方式并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的批准号1R01EY022975-01A1的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。引言视力由位于视网膜中的细胞介导，视网膜是一种位于眼睛后部的薄层状结构。位于视网膜后部的光感受器响应于光子的吸收而启动通过视网膜中的二阶神经元和三阶神经元的信号处理流，包括双极、水平和无长突细胞。位于光感受器下方的视网膜色素上皮(RPE)细胞经由视觉循环途径促进光子检测分子11-顺式视黄醛的再生，并因此对于促进该光感受器功能是必需的。内层视网膜中的视网膜神经节细胞(RGC)接收来自三阶神经元的视觉信号，并将视觉信号以动作电位的形式传递到大脑。视网膜细胞中表达的基因(包括光感受器、RPE、双极细胞和其他细胞中的转录物)中的突变导致了对视觉信号处理的破坏和视网膜变性。造成视网膜退行性疾病的突变中的许多突变导致光感受器和RPE细胞的死亡。腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)和伴随病毒(Dependovirus)属，其成员需要与诸如腺病毒的辅助病毒共感染以促进复制，并且AAV在没有辅助病毒的情况下建立潜伏感染。病毒体由25nm二十面体衣壳组成，所述25nm二十面体衣壳包含具有以下两个开放阅读框的4.7kb单链DNA基因组：rep和cap。非结构性rep基因编码病毒复制所必需的四种调节蛋白，而cap编码装配成60聚体衣壳壳的三种结构蛋白(VP1-3)。该病毒衣壳介导AAV载体的克服病毒转导的许多生物屏障-包括细胞表面受体结合、内吞作用、细胞内运输和细胞核中的解包封-的能力。
技术实现思路
本专利技术提供了具有改变的衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)病毒体，其中与野生型AAV相比，所述重组AAV(rAAV)病毒体表现出更大的跨越在玻璃体内流体与视网膜细胞之间的屏障的能力，因此具有更大的视网膜细胞感染性，并且其中rAAV病毒体包含异源核酸。本公开提供了将基因产物递送到个体中的视网膜细胞的方法。附图说明图1提供了用于开发灵长类动物视网膜AAV变体的定向进化方法的示意图。图2提供了变异AAV衣壳中肽插入和肽替换的表格。图3A至图3C提供了示例性指导RNA指导的内切核酸酶的氨基酸序列。图4提供了AAV2衣壳蛋白VP1的氨基酸序列。氨基酸587和588(NP)为粗体和加下划线的。图5提供了对应于各种AAV血清型的AAV衣壳蛋白VP1的氨基酸570-610的氨基酸序列。图6A至图6C提供了AAV衣壳蛋白环IV(GH环)区的氨基酸序列的比对。插入位点以粗体和加下划线示出。图7A至图7V提供了示例性异源基因产物的氨基酸序列。图8A至图8B提供了AAV4衣壳(图8A)和祖先AAV衣壳(图8B)的氨基酸序列。图9提供了表1。表1提供了在注射绿色荧光蛋白(GFP)-条形码文库后从光感受器回收的灵长类来源变体和对照的排名。图10提供了表2。表2提供了在注射GFP-条形码文库后从RPE细胞回收的灵长类来源的变体和对照的排名。图11描绘了灵长类动物视网膜中GFP-条形码文库的GFP表达。图12A至图12F描绘了灵长类动物视网膜中AAV的定向进化。图12F中的序列从上到下如在SEQIDNO:117至SEQIDNO:135中所示。图13A至图13Q描绘了对灵长类动物视网膜中进化的AAV变体的验证。定义术语“视网膜细胞”在本文中可指构成视网膜的任何细胞类型，诸如视网膜神经节细胞；无长突细胞；水平细胞；双极细胞；光感受器细胞，所述光感受器细胞包括视杆和视锥；Müller神经胶质细胞；星形胶质细胞(例如，视网膜星形胶质细胞)；以及视网膜色素上皮细胞。“AAV”是腺相关病毒的缩写，可用于指该病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在形式和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV-6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)、AAV9型(AAV-9)、AAV10型(AAV-10)、AAV11型(AAV-11)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV，以及绵羊AAV。参见例如，Mori等人，(2004)Virology330:375。术语“AAV”还包括嵌合AAV。“灵长类动物AAV”是指从灵长类动物分离的AAV，“非灵长类动物AAV”是指从非灵长类哺乳动物分离的AAV，“牛AAV”是指从牛科哺乳动物(例如，牛)分离的AAV，等等。如本文所用的“rAAV载体”是指这样的AAV载体，所述AAV载体包含不是AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)，通常是用于细胞遗传转化的感兴趣的序列。通常，异源多核苷酸的侧翼是至少一个，通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒两者。“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常是野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除了野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则所述颗粒通常被称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV颗粒的产生必然包括rAAV载体的产生，因此载体包含在rAAV颗粒内。“包装”是指一系列细胞内事件，该一系列细胞内事件导致AAV颗粒的装配和衣壳化。AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAVrep和cap在本文中被称为AAV“包装基因”。AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的各种此类辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘病毒)。腺病毒包括许多不同的亚群，但是最常用的是亚群C的5型腺病毒。许多人、非人哺乳动物和禽类来源的腺病毒是已知的并且可从诸如ATCC等保藏机构获得。疱疹病毒家族的病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和艾普斯登-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；这些病毒也可以从诸如ATCC等保藏机构获得。“辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的功能，所述功能允许AAV复制和包装(结合本文所述的关于复制和包装的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述重组腺相关病毒(rAAV)病毒体包含：/na)变异AAV衣壳蛋白，其中所述变异AAV衣壳蛋白包含式I-VI中任一式的异源肽的插入，并且其中与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予增强的视网膜细胞感染性；以及/nb)包含编码异源基因产物的核苷酸序列的异源核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,871;20170720 US 62/535,0421.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述重组腺相关病毒(rAAV)病毒体包含：
a)变异AAV衣壳蛋白，其中所述变异AAV衣壳蛋白包含式I-VI中任一式的异源肽的插入，并且其中与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予增强的视网膜细胞感染性；以及
b)包含编码异源基因产物的核苷酸序列的异源核酸。


2.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述rAAV病毒体表现出增强至少5倍的视网膜细胞感染性。


3.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对视网膜细胞的感染性相比，所述rAAV病毒体表现出增强至少10倍的视网膜细胞感染性。


4.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽的插入置换所述亲本AAV衣壳蛋白的5个氨基酸至20个氨基酸的连续段。


5.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中插入位点在对应于AAV2的VP1的氨基酸570和611的氨基酸之间，或者另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置处。


6.根据权利要求4所述的rAAV病毒体，其中所述插入位点位于对应于AAV2的VP1的氨基酸587和588的氨基酸之间，或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置处；或者，其中所述插入位点位于对应于AAV2的VP1的氨基酸585和598的氨基酸之间，或者位于另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置处。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的rAAV病毒体，其中基因产物是干扰RNA或适体。


8.根据权利要求1-6中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是多肽。


9.根据权利要求8所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是神经保护多肽、抗血管生成多肽，或增强视网膜细胞的功能的多肽。


10.根据权利要求8所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是选自II型CRISPR/Cas多肽、V型CRISPR/Cas多肽和VI型CRISPR/Cas多肽的RNA指导的内切核酸酶。


11.根据权利要求10所述的rAAV病毒体，其中所述RNA指导的内切核酸酶是无酶促活性的II型CRISPR/Cas多肽。


12.根据权利要求10所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是RNA指导的内切核酸酶和指导RNA。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式I的肽：LA(L/N)(I/Q)(Q/E)(D/H)(S/V)(M/K)(R/N)A(SEQIDNO:136)。


14.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含(21)LALIQDSMRA(SEQIDNO:35)或(22)LANQEHVKNA(SEQIDNO:2)。


15.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式II的肽：TX1X2X3X4X5X6X7X8GLX9(SEQIDNO:137)，其中：
X1是G、V或S；
X2是V、E、P、G、D、M、A或S；
X3是M、V、Y、H、G、S或D；
X4是R、D、S、G、V、Y、T、H或M；
X5是S、L、G、T、Q、P或A；
X6是T、A、S、M、D、Q或H；
X7是N、G、S、L、M、P、G或A；
X8是S、G、D、N、A、I、P或T；并且
X9是S或N。


16.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含：(1)TGVMRSTNSGLN(SEQIDNO:6)；(2)TGEVDLAGGGLS(SEQIDNO:7)；(3)TSPYSGSSDGLS(SEQIDNO:8)；(4)TGGHDSSLDGLS(SEQIDNO:9)；(5)TGDGGTTMNGLS(SEQIDNO:98)；(6)TGGHGSAPDGLS(SEQIDNO:99)；(7)TGMHVTMMAGLN(SEQIDNO:100)；(8)TGASYLDNSGLS(SEQIDNO:101)；(9)TVVSTQAGIGLS(SEQIDNO:20)；(10)TGVMHSQASGLS(SEQIDNO:21)；(11)TGDGSPAAPGLS(SEQIDNO:22)；或者(12)TGSDMAHGTGLS(SEQIDNO:23)


17.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式III的肽：TGX1X2X3X4X5X6X7GLS(SEQIDNO:138)，其中：
X1是V、E、P、G、D、M、A或S；
X2是M、V、Y、H、G、S或D；
X3是R、D、S、G、V、Y、T、H或M；
X4是S、L、G、T、Q、P或A；
X5是T、A、S、M、D、Q或H；
X6是N、G、S、L、M、P、G或A；并且
X7是S、G、D、N、A、I、P或T。


18.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含：(2)TGEVDLAGGGLS(SEQIDNO:7)；(4)TGGHDSSLDGLS(SEQIDNO:9)；(5)TGDGGTTMNGLS(SEQIDNO:98)；(6)TGGHGSAPDGLS(SEQIDNO:99)；(8)TGASYLDNSGLS(SEQIDNO:101)；(10)TGVMHSQASGLS(SEQIDNO:21)；(11)TGDGSPAAPGLS(SEQIDNO:22)；或(12)TGSDMAHGTGLS(SEQIDNO:23)。


19.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式IV的肽：X1GX2X3X4X5X6X7X8GLSPX9TX10X11(SEQIDNO:139)，其中
X1是T或N；
X2是L、S、A或G；
X3是D或V；
X4是A、G或P；
X5是T或D；
X6是R或Y；
X7是D、T或G；
X8是H、R或T；
X9是V或A；
X10是G或W；并且
X11是T或A。


20.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含：(13)TGLDATRDHGLSPVTGT(SEQIDNO:24)；(14)TGSDGTRDHGLSPVTWT(SEQIDNO:25)；(15)NGAVADYTRGLSPATGT(SEQIDNO:26)；或(16)TGGDPTRGTGLSPVTGA(SEQIDNO:27)。


21.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式V的肽：TGX1DX2TRX3X4GLSPVTGT(SEQIDNO:140)，其中
X1是L、S、A或G；
X2是A、G或P；
X3是D、T或G；并且
X4是H、R或T


22.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽是式VI的肽：LQX1X2X3RX4X5X6X7X8X9VNX10Q(SEQIDNO:141)，其中
X1是K或R；
X2是N、G或A；
X3是A、V、N或D；
X4是P、I或Q；
X5是A、P或V；
X6是S、T或G；
X7是T或V；
X8是E、L、A或V；
X9是S、E、D或V；并且
X10是F、G、T或C。


23.根据权利要求1-12中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述异源肽包含：(17)LQKNARPASTESVNFQ(SEQIDNO:28)；(18)LQRGVRIPSVLEVNGQ(SEQIDNO:29)；(19)LQRGNRPVTTADVNTQ(SEQIDNO:30)；或(20)LQKADRQPGVVVVNCQ(SEQIDNO:31)。


24.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)根据权利要求1-23中任一项所述的重组腺相关病毒病毒体；以及
b...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·V·沙弗尔，L·C·伯恩，T·P·戴，J·G·弗兰纳里，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US