酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种酿酒酵母工程菌的构建方法及利用该酿酒酵母工程菌制备桦木酸的方法，所述酿酒酵母工程菌为，在酿酒酵母中导入了羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs和细胞色素P450酶编码基因RoCYP‑34445、细胞色素P450还原酶编码基因RoCPR，该基因能够编码桦木酸生物合成途径中的关键酶，构建得到的工程菌采用生物合成的方法制备桦木酸，该方法羽扇豆醇转化为桦木酸的转化率高，产量大，且环境友好。

Construction of engineered Saccharomyces cerevisiae and preparation of betulinic acid

The invention provides a construction method of an engineering strain of Saccharomyces cerevisiae and a method for preparing betulinic acid by using the engineering strain of Saccharomyces cerevisiae. The engineering strain of Saccharomyces cerevisiae includes the introduction of the gene atlups of lupin synthetase, the gene rocyp \u2011 34445 of cytochrome P450 enzyme coding, and the gene rocpr of cytochrome P450 reductase coding, which can code the biological synthesis of betulinic acid The key enzyme in the pathway, the engineering bacteria constructed by the method of biosynthesis to prepare betulinic acid, the method of conversion of lupin alcohol to betulinic acid has high conversion rate, large output, and environmental friendly.

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法
本专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法。
技术介绍
桦木酸(betulinicacid)和以其为起始物的衍生物在抗肿瘤和抗HIV新药创制方面表现出光明的应用前景。早在1995年，桦木酸具有很好的抗黑色素瘤的作用。之后，以桦木酸为起始物，许多强抗肿瘤活性衍生物被合成。此外，许多桦木酸衍生物具有很好的抗HIV的作用。例如3-O-(3,3-dimethylsuccinyl)betulinicacid(bevirimat)对野生型和耐药型HIV-1都有强抑制其复制的作用，并且该化合物已经在I和II期临床取得成功。近期，通过以桦木酸为起始物，许多新的抗HIV衍生物被合成出来，其中一些化合物可抑制耐bevirimatHIV-1的变种病毒。以上桦木酸衍生物均是已桦木酸为起始化合物，通过半合成的方法获得的。因此，对这些分子进行新药开发，首先解决的关键问题是药源问题，即如何获得工业化规模的桦木酸。桦木酸在白桦树皮中的含量最高，但是也只有0.025％。由于桦木醇在白桦树皮中含量高(25％)，因此目前主要以桦木醇为起始物，半合成桦木酸。半合成的方法制备桦木酸，同样需要大量提取植物材料，并且在化学合成中使用大量化学试剂，环境不友好。近期，有研究报道了一个能够分别氧化齐墩果烷和熊果烷为齐墩果酸和熊果酸的酶CYP716AL1。由于该酶具有一定底物选择的泛宽性，也可氧化羽扇豆醇得少量桦木酸。以CYP716AL1催化最后一步氧化反应，在酿酒酵母中重建桦木酸的生物合成途径，但其产量仅为0.01mg/L，产量很低。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于提供一种产量高、环境友好的桦木酸生物合成方法。具体技术方案如下：一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。所述细胞色素还原酶基因RoCPR，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.8所示的RoCPR-F和核苷酸序列如SEQ.IDNO.9所示的RoCPR-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。所述细胞色素P450基因RoCYP-34445为，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.18所示的RoCYP-34445-F、和核苷酸序列如SEQ.IDNO.19所示的RoCYP-34445-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。优选地，上述酿酒酵母工程菌的构建方法还包括：向酿酒酵母中转化入含有羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的重组质粒。所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs为，以拟南芥cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.1所示的LUP-F、和核苷酸序列如SEQ.IDNO.2所示的LUP-R为引物，PCR扩增得到；所述拟南芥cDNA由提取拟南芥的总RNA后进行反转录得到。优选地，所述细胞色素还原酶基因RoCPR的核苷酸序列如SEQ.IDNO.7所示。优选地，所述细胞色素P450基因RoCYP-34445的核苷酸序列如SEQ.IDNO.17所示。优选地，所述羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的核苷酸序列如SEQ.IDNO.3所示。优选地，所述酿酒酵母为S.cerevisiaeBY4741。本专利技术的目的还在于提供一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，具体技术方案如下：一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，由上述的酿酒酵母工程菌的构建方法构建得到。本专利技术的目的还在于提供一种桦木酸的制备方法，具体技术方案如下：将上述构建方法构建得到的酿酒酵母工程菌，接种于培养基中培养，萃取旋干复溶，即得。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术所述用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，发现、研究并构建得到了含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒，该基因能够编码桦木酸生物合成途径中的关键酶，构建得到的工程菌采用生物合成的方法制备桦木酸，该方法羽扇豆醇转化为桦木酸的转化率高，产量大，且环境友好。而且，本专利技术所述的制备桦木酸的酿酒酵母工程菌，同时包含了桦木酸生物合成通路中相关酶对应的三个基因：羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs、细胞色素P450基因RoCYP-34445和细胞色素还原酶基因RoCPR；三个基因在该酿酒酵母工程菌中构建形成了桦木酸的生物合成通路，通过羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs实现桦木酸上游底物羽扇豆醇的合成，并结合细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445，直接将羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs产生的羽扇豆醇氧化，即可制备得到桦木酸，所得工程菌桦木酸的产量高。本专利技术所述的桦木酸的制备方法，利用了代谢工程的方法，在酿酒酵母中构建得到桦木酸的生物合成途径，通过发酵方法，可制备得到高产量的桦木酸，有利于桦木酸的工业化、规模化生产。同时，避免了桦木酸半合成的制备方法中大量消耗植物材料和化学试剂，该方法具有环境友好的特点。附图说明图1为分别含有不同表达载体的酿酒酵母以羽扇豆醇为底物的发酵产物的色谱检测实验结果；图2A为pESC-URA质粒图谱，图2B为pESC-LEU质粒图谱；图3A为同时导入了RoCYP-34445、RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；图3B为同时导入了RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；图3C为导入了空载体的酿酒酵母培养物提取得到的产物的色谱检测图谱；图4为同时导入了RoCYP-34445、RoCPR和AtLUPs基因的酿酒酵母培养物提取得到的产物进行GC-MS检测的质谱检测图谱。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1表达载体构建1.材料与方法用于构建桦木酸合成途径的宿主菌株为酿酒酵母S.cerevisiaeBY4741，表达载体为拷贝的质粒pESC-URA与pESC-LEU。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于制备桦木酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：向酿酒酵母中转化含有细胞色素还原酶基因RoCPR和细胞色素P450基因RoCYP-34445的重组质粒。


2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素还原酶基因RoCPR，以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.8所示的RoCPR-F和核苷酸序列如SEQ.IDNO.9所示的RoCPR-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。


3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述细胞色素P450基因RoCYP-34445为：以迷迭香cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ.IDNO.18所示的RoCYP-34445-F、和核苷酸序列如SEQ.IDNO.19所示的RoCYP-34445-R为引物，经PCR扩增得到；所述迷迭香cDNA由提取迷迭香的总RNA后进行反转录得到。


4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，还包括：向酿酒酵母中转化含有羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs的重组质粒。


5.根据权利要求4所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾佳辰，黄嘉键，朱建勋，安天悦，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44