一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用。本发明专利技术公开了一种高产红景天苷的工程菌，它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌。本发明专利技术还公开了采用前述工程菌制备红景天苷的发酵。本发明专利技术工程菌可以高产红景天苷和/或酪醇，经济价值高，工业应用前景良好。

An engineering strain with high yield of salidroside and / or tyrosol and its application

The invention relates to the field of bioengineering, in particular to an engineering bacterium with high yield of salidroside and / or tyrosol and its application. The invention discloses an engineering strain with high yield of salidroside, which is a recombinant yeast that mutates the codon of aro4 gene encoding the 229th amino acid into the codon encoding leucine, the codon of 141 glycine of aro7 gene into the codon encoding serine, and the codon of 222 lysine of aro3 gene into the codon encoding leucine. The invention also discloses a fermentation for preparing salidroside by using the engineering bacteria. The engineering bacteria of the invention can produce salidroside and / or tyrosol with high economic value and good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用本申请要求于2018年09月25日提交中国专利局、申请号为201811116170.0、专利技术名称为“一种高产红景天苷的工程菌及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用。
技术介绍
红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今己有1000多年的应用历史，其具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用，还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷及其苷元酪醇作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，对红景天苷及其苷元酪醇的需求也越来越高。红景天苷的苷元酪醇(Tyrosol)，其化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)pHeno1,分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式如式Ⅰ所示：酪醇(对羟基苯乙醇)作为苯乙醇的一种衍生物，是源于橄榄油的一种天然抗氧化剂，同时具有抗疲劳、抗辐射、调节机体免疫等多种作用。除自身具有重要价值外，酪醇是合成多种有机化合物及衍生物的重要前体物质。例如，用酪醇合成的羟基酪醇和红景天苷都具有较高的药用价值，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，在医药和功能食品方面应用广泛。红景天苷(Salidroside)的化学名称为2-(4-hydroxypHenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9，结构式如式Ⅱ所示：目前，红景天苷及其苷元酪醇的主要生产途径是从红景天植株中提取。然而，由于自然生长的红景天植物资源稀有，人工栽培的红景天植物的成本也较高，并且，其红景天苷含量较低，如最常用的高山红景天和大花红景天中红景天苷的含量仅有0.5％-0.8％，提取的成本高，效率低。而化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；植物组织培养反应周期长，效价较低。生物合成对自然环境的依赖较小，有可能克服从红景天苷植物中提取红景天苷及其苷元酪醇存在的上述问题。酪醇的生物合成来说，以大肠杆菌为载体进行生产受到大肠内毒素挑战。而以酿酒酵母为载体的合成中，在缺省培养条件下，酪醇的浓度只能达到1.326g/L。红景天苷的化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；已经发现的功能微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低；在已经人工构建好的大肠杆菌生物合成途径中，红景天苷的产物浓度较低。王梦亮等以D-葡萄糖和酪醇为底物，经筛选得到的微生物菌株作用，成功合成红景天苷(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究，催化学报，2006，27(3)：233-236)，但是得到较高产物浓度非常低。现有文献报道了通过改变大肠杆菌和酿酒酵母的基因来提高红景天苷产物浓度的方式，但是也不尽如人意，导致后期提取仍然存在难度大、成本高的问题。如：毕慧萍等，以大肠杆菌为平台构建的高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2菌株，实现了一条不同于植物的酪醇生物合成通路。在构建的菌株中，酪醇的产量可达600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L，淫羊藿次苷D2的产量可达40mg/L。(毕慧萍，白艳芬，庄以彬等.一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用.CN104940575A,2015.)；刘涛等在构建的产红景天苷重组大肠杆菌研究中，通过敲除或沉默galE、galT、ugd，并导入过表达ARO10、pgm、UGT73B6、galU、T7ploymerase基因，红景天苷的最高产量能够提升至0.7g/L(刘涛，毕慧萍，庄以彬等，一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用.CN107435049A，2016.)；华东理工大学刘涛课题组已经利用酿酒酵母从头合成红景天苷，但产量较低，只有732.5mg/L(JiangJ,YinH,WangS,etal.MetabolicEngineeringofSaccharomycescerevisiaeforHigh-LevelProductionofSalidrosidefromGlucose.JournalofAgricultural&FoodChemistry,2018.)。虽然在随后的重组大肠中红景天苷的产量提高到0.7g/L的浓度，低浓度无疑增加了后期提取的难度和成本；以葡萄糖和木糖两种碳源为底物的两种大肠杆菌共培养技术，虽能获得6.03g/L的红景天苷，使用价格更贵的木糖为底物，同时也增加了生产成本；虽然通过优化酿酒酵母合成途径，将以廉价葡萄糖为底物合成红景天苷产量提高到1-1.1g/L，但对于工业化生产来说，任有优化提高需求。因此，实现进一步优化酪醇和红景天苷在微生物体内生物全合成途径，在控制生产成本的同时并得到更高的产物浓度具有重要的科研价值及社会效益。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种新的工程菌，其可以高产红景天苷和/或酪醇。本专利技术高产红景天苷的工程菌，它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子(即将ARO4基因突变为ARO4K229L)、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子(即ARO7基因突变为ARO7G141S)、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子(即ARO3基因突变为ARO3K222L)的重组酵母菌。ARO4基因：是指，GeneID:852551，Chromosome:II；NC_001134.8(716882..717994)。ARO7基因：是指，GeneID:856173，Chromosome:XVI；NC_001148.4(674861..675631)。ARO3基因：是指，GeneID:851605，Chromosome:IV；NC_001136.10(521816..522928)。所述ARO4基因第229位的密码子为TTG，所述ARO7基因第141位的密码子为agt；第222位的密码子为CTA，具体地：ARO4K229L的序列如SEQIDNo.1所示：atgagtgaatctccaatgttcgctgccaacggcatgccaaaggtaaatcaaggtgctgaagaagatgtcagaattttaggttacgacccattagcttctccagctctccttcaagtgcaaatcccagccacaccaacttctttggaaactgccaagagaggtagaagagaagctatagatattattaccggtaaagacgacagagttcttgtcattgtcggtccttgttccatccatg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产红景天苷的工程菌，其特征在于：它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌；ARO4/ARO7/ARO3基因来源的酿酒酵母菌株不限于S288C和/或CEN.PK菌株。/n

【技术特征摘要】
20180925 CN 20181111617001.一种高产红景天苷的工程菌，其特征在于：它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌；ARO4/ARO7/ARO3基因来源的酿酒酵母菌株不限于S288C和/或CEN.PK菌株。


2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述ARO4基因第229位的密码子为TTG，所述ARO7基因第141位的密码子为AGT；第222位的密码子为CTA。


3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌中，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2失活；优选地，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2分别突变为SEQIDNo.4～6所示的序列。


4.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌中包含携带UGP1，PGM和/或RrU8GT33的严谨性质粒PRS413质粒；优选地，所述重组酵母菌中还包含携带ARO10、ARO2、RKI1、TKL1和/或ARO1的整合型pRS425质粒。


5.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌还包括突变后的ARO4、ARO7、ARO3的表达片段扩增、串联后获得的串联片段ARO4p-ARO4-ARO4t-ARO7p-ARO7-ARO7t-ARO3p-ARO3-ARO3t；
所述突变后的ARO4、ARO7、ARO3分别为ARO4K229L、ARO7G141S和ARO3K222L。


6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述串联片段重组到酵母基因组的308a位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云孜，刘化一，贾佳，曹凤，
申请(专利权)人：成都薇合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51