一种解酯耶氏酵母YW100-1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种解酯耶氏酵母YW100‑1及其应用，所述解酯耶氏酵母YW100‑1是在解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1，二羟基丙酮激酶DAK2和NADH激酶POS5，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2和3‑磷酸甘油脱氢酶基因GPD2获得的。本发明专利技术菌株以甘油为碳源时，丙酮酸产量增加了66.2％，达到121.2g/L，为丙酮酸工业化生产提供了优良菌株。

Yeasts yw100-1 and its application

The invention discloses Yersinia lyw100 \u2011 1 and its application. The Yersinia lyw100 \u2011 1 overexpression of glycerol kinase gut1, Gut2, gcy1, dak1, dak2 and pos5 in glycerol metabolism in Yersinia lyzae, and knockout of diacylglycerol acyltransferase in Yersinia lyzae Dga2 and gpd2 were obtained. When glycerol is used as carbon source, the yield of pyruvic acid is increased by 66.2% to 121.2g/l, which provides an excellent strain for industrial production of pyruvic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种解酯耶氏酵母YW100-1及其应用(一)
本专利技术涉及一种解酯耶氏酵母工程菌的构建方法和应用，属生物工程
(二)
技术介绍
丙酮酸作为微生物代谢途径中的中间体，也是重要的有机酸之一，在生物化工，制药，食品以及科学领域中具有广泛的作用。在医药工业，丙酮酸是一种重要的医药中间体，可用于合成左旋多巴，消炎镇痛药辛可芬，抗结核药异烟肼丙酮酸钙，噻咪唑药物等，此外，丙酮酸盐类(如丙酮酸钙，丙酮酸钾，丙酮酸肌酸盐等)广泛应用于减肥保健品药类。在食品行业，丙酮酸作为食品添加剂，具有天然的防腐和保鲜功效。在化工行业，丙酮酸乙酯作为皮肤美白剂，可以抑制皮肤中的黑色素的形成，具有很好的皮肤美白功效。此外，丙酮酸作为新一代的生物燃料的前体，国内外市场需求迅速增长，具有广阔的应用价值。目前丙酮酸生产的方法主要有化学合成法，酶转化法，微生物发酵法三大类。化学合成法主要是以酒石酸为原料，化学合成丙酮酸，但该方法污染重，成本高，工业化生产受到了限制。酶转化法主要是利用微生物中的脱氢酶系，将乳酸转化为丙酮酸，但是该方法转化率低，成本高，目前还没有实现工业化生产。微生物发酵法主要是利用微生物，以葡萄糖或者甘油等廉价为碳源，通过微生物发酵，直接生产丙酮酸。目前微生物发酵法使用的菌株有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，光滑球拟酵(Torulopsisglabrata)，解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)等。与化学合成法和酶转化法相比，具有污染小，转化率高，成本低等优点，也是目前工业化的主要方法。尽管解酯耶氏酵母具有较好的丙酮酸生产能力，但是其利用甘油合成丙酮酸的转化率以及合成速率仍有待提高，丙酮酸降解速度偏快导致无法大量积累。解酯耶氏酵母中存在两条甘油分解代谢途径，一条是甘油-3-磷酸途径，在细胞质中甘油在甘油激酶(由GUT1编码)的作用下磷酸化为甘油-3-磷酸，随后穿梭进入线粒体，在甘油-3-磷酸脱氢酶(由GUT2编码)的作用下氧化甘油-3-磷酸为磷酸二羟基丙酮，随后磷酸二羟基丙酮又被运回细胞质进入糖酵解代谢途径。另一条是二羟基丙酮(DHA)途径，在此途径中甘油脱氢酶(由GCY1编码)将甘油氧化为DHA，随后在二羟基丙酮激酶(由DAK1和DAK2编码)的作用下磷酸化为磷酸二羟基丙酮进入糖酵解代谢途径。解酯耶氏酵母作为一种高产油脂酵母，二酰基甘油酰基转移酶(由DGA2编码)可以利用磷酸二羟基丙酮合成油脂的重要组成部分三酰甘油。甘油的合成先经磷酸二羟丙酮，转化为3-磷酸甘油，随后经3-磷酸甘油脱氢酶(由GPD1，GPD2编码)，合成甘油。有研究表明，GPD2的敲除会使得胞内NADH的积累，从而打破NADH/NADPH平衡影响菌体的生长，而Pos5作为一种NADH激酶，可以利用ATP将NADH磷酸化为NADPH。鉴于此，本专利技术将通过增强甘油-3-磷酸途径和二羟基丙酮途径来强化甘油的分解代谢途径来加速甘油的分解，同时减弱甘油的合成途，从而实现丙酮酸在细胞内的大量积累。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高产丙酮酸的解酯耶氏酵母工程菌，及其构建与应用，为丙酮酸的工业化生产提供优良菌种。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种高产丙酮酸的解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)YW100-1，所述解酯耶氏酵母YW100-1是在解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1和二羟基丙酮激酶DAK2，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2来增强甘油的分解代谢，敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD2和过量表达NADH激酶POS5来减少甘油的合成代谢，获得的一株高产丙酮酸的解酯耶氏酵母工程菌。进一步，所述解酯耶氏酵母YW100-1按如下方法构建：(1)将来源于解酯耶氏酵母的GUT1基因、GUT2基因，以及启动子pEXP1片段，通过重叠延伸获得GUT1-pEXP1-GUT2，连接到载体JMP113上，得到载体E14；(2)将构建的载体E14用NotI酶切，转入到野生型解酯耶氏酵母AS2.1405中，得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS102；(3)将来源于解酯耶氏酵母的GCY1，DAK1，DAK2基因，启动子pTEF，pEXP1，pGPD，以及用于整合的同源臂KU70的5’端和3’端，通过重叠延伸分别获得5’KU70-URA3-pTEF-DAK1，DAK1-pEXP1-DAK2-pGPD，pGPD-GYC1-3’KU70三个大片段，转入到ZS102中，得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS104；(4)将来源于解酯耶氏酵母的POS5基因以及pTEF，以及用于敲除GPD2的5’端GPD2和3’端GPD2，通过重叠延伸获得5’GPD2-URA3-pTEF-POS5和POS5-3’GPD2二个片段，转入到ZS104中，得到同源重组后的解酯耶氏酵母工程菌ZS106；(5)将用于敲除的5’端和3’端DGA2，通过重叠延伸获得5’DGA2-URA3-DGA2片段，转入到ZS106中，得到解酯耶氏酵母YW100-1。进一步，甘油激酶GUT1基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，甘油激酶GUT2基因核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，二羟基丙酮激酶DAK1基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，二羟基丙酮激酶DAK2基因核苷酸序列为SEQIDNO.4所示，甘油脱氢酶GCY1基因核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，NADH激酶POS5基因核苷酸序列为SEQIDNO.6所示，二酰基甘油酰基转移酶5’DGA2基因核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，二酰基甘油酰基转移酶3’DGA2基因核苷酸序列为SEQIDNO.8所示，启动子pEXP1核苷酸序列为SEQIDNO.9所示，5’KU70核苷酸序列为SEQIDNO.10所示，Loxp-URA3-Loxp核苷酸序列为SEQIDNO.11所示，启动子pTEF核苷酸序列为SEQIDNO.12所示，启动子pGPD核苷酸序列为SEQIDNO.13所示，3’KU70核苷酸序列为SEQIDNO.14所示，3-磷酸甘油脱氢酶5’GPD2基因核苷酸序列为SEQIDNO.15所示，3’GPD2基因核苷酸序列为SEQIDNO.16所示。本专利技术所述解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)YW100-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年3月18日，保藏号为CCTCCNO：M2019168，地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。本专利技术还提供一种所述解酯耶氏酵母YW100-1在发酵甘油制备丙酮酸中的应用，所述应用为下列方法之一：(1)摇瓶发酵：解酯耶氏酵母YW100-1接种于YPD培养基中，于30℃，200rpm培养24h，获得种子液；以初始菌体浓度OD600＝0.05接种于YNG培养基中，于30℃，200rpm发酵培养至OD600为4.0-5.0(优选4.5)时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产丙酮酸的解酯耶氏酵母YW100-1，其特征在于所述解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)YW100-1是在解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1，二羟基丙酮激酶DAK2和NADH激酶POS5，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2和3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD2获得的。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产丙酮酸的解酯耶氏酵母YW100-1，其特征在于所述解酯耶氏酵母(Yarrowialipolytica)YW100-1是在解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1，二羟基丙酮激酶DAK2和NADH激酶POS5，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2和3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD2获得的。


2.如权利要求1所述解酯耶氏酵母YW100-1，其特征在于所述解酯耶氏酵母YW100-1按如下方法构建：
(1)将来源于解酯耶氏酵母的GUT1基因、GUT2基因，以及启动子pEXP1片段，通过重叠延伸获得GUT1-pEXP1-GUT2，连接到载体JMP113上，得到载体E14；
(2)将构建的载体E14用NotI酶切，转入到野生型解酯耶氏酵母AS2.1405中，得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS102；
(3)将来源于解酯耶氏酵母的GCY1，DAK1，DAK2基因，启动子pTEF，pEXP1，pGPD，以及用于整合的同源臂KU70的5’端和3’端，通过重叠延伸分别获得5’KU70-URA3-pTEF-DAK1，DAK1-pEXP1-DAK2-pGPD，pGPD-GYC1-3’KU70三个大片段，转入到ZS102中，得到得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS104；
(4)将来源于解酯耶氏酵母的POS5基因以及pTEF，以及用于敲除GPD2的5’端GPD2和3’端GPD2，通过重叠延伸获得5’GPD2-URA3-pTEF-POS5和POS5-3’GPD2二个片段，转入到ZS104中，得到同源重组后的解酯耶氏酵母工程菌ZS106；
(5)将用于敲除的5’端和3’端DGA2，通过重叠延伸获得5’DGA2-URA3-DGA2片段，转入到ZS106中，得到解酯耶氏酵母YW100-1。


3.如权利要求1所述解酯耶氏酵母YW100-1，其特征在于所述甘油激酶GUT1基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，甘油激酶GUT2基因核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，二羟基丙酮激酶DAK1基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，二羟基丙酮激酶DAK2基因核苷酸序列为SEQIDNO.4所示，甘油脱氢酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁围，钟爽，孙杰，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33