过表达phoP-phoR的重组BCG制造技术

本发明专利技术提供活的重组牛分枝杆菌‑BCG菌株和结核病(TB)疫苗或免疫原性组合物，其包含能够过表达的核酸，所述核酸编码PhoP和PhoR蛋白。本发明专利技术还提供使用所述菌株治疗或预防哺乳动物免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的攻击的方法。

Recombinant BCG with overexpression of PhoP phor

The invention provides a live recombinant Mycobacterium bovis BCG strain and a tuberculosis (TB) vaccine or immunogenic composition, which comprises a nucleic acid capable of over expression, the nucleic acid encoding PhoP and phor proteins. The invention also provides a method for treating or preventing mammals from being attacked by Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium bovis using the strain.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】过表达phoP-phoR的重组BCG专利
本专利技术涉及结核病(TB)疫苗。特别是，本专利技术提供一种重组BCG，其过表达phoP-phoR双组分调控系统并赋予针对结核病的增强防护。专利技术背景由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(M.tb)引起的结核病(TB)与HIV/AIDS并列为全球感染性疾病死亡率的主要原因。2014年，TB导致150万人死亡和960万新感染。缺少防护性疫苗、耐药M.tb菌株的出现以及高比率的M.tb/HIV合并感染继续助长TB流行。卡介苗(BacilleCalmette-Guérin)(BCG)为唯一获得许可的TB疫苗，并且尽管其对儿童中传播形式的TB有效1,2，但BCG对成人肺部TB(该疾病的最常见和最具传染性的形式)的防护作用有限。临床研究表明，可变功效范围为0-80%3-5。解释BCG可变功效的一个假设涉及BCG菌株的异质性6。BCG源自从1908-1921年通过体外传代的牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)的毒力菌株。随后的全世界分布和连续传代直到20世纪60年代导致了许多BCG亚株。BCG菌株之间的遗传差异，包括基因组区的缺失和重复以及单核苷酸多态性(SNP)，已被充分记录7-12。这些差异是否影响BCG对TB的有效性是一个有争议的问题6,13，并且目前没有足够的数据来推荐一种特定菌株，因为缺乏直接比较多种BCG菌株的临床试验14。目前改进TB疫苗的策略包括开发亚单位和活的减毒疫苗15,16。然而，没有一种亚单位疫苗在动物模型中被证明优于BCG。在最近的临床试验中，在接种BCG的婴儿中MVA85A(最先进的亚单位疫苗)缺少防护功效17进一步强调了活疫苗研究的重要性18。已经探索了许多方法来开发活疫苗，包括产生重组BCG和减毒的M.tb菌株。其中，仅有少数已经证明在动物模型中优于BCG，包括已进入临床试验的3种活疫苗(rBCG30、VPM1002和MTBVAC)16。rBCG30为过表达抗原Ag85B的重组BCG-Tice菌株。与用亲本BCG免疫的那些相比较，豚鼠接种rBCG30随后M.tb攻击导致细菌负荷减少0.5-1.0log10并延长存活19,20。然而，这种效应对BCG-Tice为特异性的，因为BCG-Connaught中Ag85B的过表达并未改善防护作用20。VPM1002为表达单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的李斯特菌溶胞素的重组BCG。这种疫苗的基本原理为以下概念：李斯特菌溶胞素可促进BCG的吞噬体逃逸到巨噬细胞的细胞溶质中，从而增加抗原呈递21。与亲本菌株相比较，用VPM1002接种的BALB/c小鼠显示M.tb负荷减少0.5-1.0log1021,22，然而，在豚鼠模型中没有观察到这种防护作用的改善23。将M.tb的phoP缺失突变体作为候选疫苗进行评估，其原因是与BCG相比，减毒M.tb可能与M.tb的临床菌株共具更多抗原24。M.tbΔphoP在小鼠中提供与BCG类似的防护作用，但在豚鼠中对M.tb攻击具有更好的防护作用24,25。为了确保安全性，缺失fadD26以进一步减毒菌株(MTBVAC)，其在SCID小鼠中显示出与BCG-Pasteur或BCG-Danish相当的安全性特征26。专利技术概述本专利技术提供结核病疫苗，其包含过表达phoP-phoR(一种双组分调控系统)的重组分枝杆菌(mycobacterium)菌株。目前的BCG疫苗株的免疫原性不足以诱导宿主中针对结核病的最佳防护作用。相比之下，过表达phoP-phoR的本专利技术基因工程BCG菌株具有更高的免疫原性并提供更好的针对结核病的防护作用。以足以引起PhoP-PhoR调控的基因或蛋白的2(或更多)倍诱导的水平过度产生phoP-phoR的任何基因工程分枝杆菌可有利地用于本专利技术的实践中。当将本专利技术的重组分枝杆菌给予哺乳动物宿主时，在宿主中通过CD4+T细胞的IFN-γ产生增加，并且该重组分枝杆菌提供针对结核病的防护作用。已有十多项研究比较了在人类中由不同BCG菌株诱导的免疫反应14,27。然而，在大多数这些研究中仅包括两种或三种BCG菌株。研究设计的差异(比如BCG菌株的选择、免疫的年龄和群体大小)导致了不确定的结果14。尽管如此，这些研究中最大的一项研究，其由WHO在20世纪70年代领导，在儿童中比较了11种BCG菌株28。BCG-Prague被发现为异常值，呈现出比其他BCG菌株(包括BCG-Danish、-Pasteur、-Glaxo、-Japan、-Russia和-Moreau)更低的结核菌素反应性28,29。对其免疫原性低的担忧导致它在几乎30年的使用后于1981年在捷克斯洛伐克由BCG-Russia取代30。BCG-Prague的结核菌素反应性低的原因尚不清楚。然而，本专利技术人发现BCG-Prague中的phoP为假基因，含有破坏C-末端DNA结合结构域的1-bp插入9。该突变对于BCG-Prague为特异性的，因为所有其他BCG菌株均含有野生型(WT)phoP。PhoP为PhoP-PhoR双组分系统的反应调控因子，并且正调节M.tb中的40多种基因，包括两种已用于构建亚单位疫苗的T细胞抗原(Ag85A,PPE18)16,31。因此，本专利技术人假设BCG-Prague的免疫原性低为phoP突变的结果9，并且BCG中phoP的过表达可提供增强免疫原性的有效手段，并因此提供保护功效。一致地，本专利技术人在WO2011/130878A1中显示BCG-Prague与WTphoP的互补或者BCG-Japan中phoP的过表达增加了IFN-γ的产生。本专利技术基于专利技术人的发现，即BCG菌株比如BCG-Japan中phoP-phoR的过表达增强了其免疫原性和防护功效，表明这可能是改善BCG的一般适用方法。在本专利技术中证实，与亲本BCG相比，用重组菌株rBCG-Japan/PhoPR接种C57BL/6小鼠诱导通过CD4+T细胞的更高水平的IFN-γ产生。与用亲本BCG免疫的动物相比较，用rBCG-Japan/PhoPR接种的豚鼠更好地受到防护免受结核分枝杆菌的攻击，显示出存活时间显著更长、细菌负荷减少和病理学更不严重。总之，已证实过表达phoP-phoR的本专利技术的重组BCG比目前的BCG赋予增强的针对结核病的防护作用。PhoP的示例性的氨基酸序列如图1A[SEQIDNO:1]所示，和编码它的示例性的核苷酸序列如图1B[SEQIDNO:2]所示。PhoR的示例性的氨基酸序列如图1C[SEQIDNO:3]所示，和编码它的示例性的核苷酸序列如图1D[SEQIDNO:4]所示。这些序列代表来自BCG-Pasteur的PhoP和PhoR，如巴斯德研究所网站(http://genodb.pasteur.fr/cgi-bin/WebObjects/GenoList)上可获得的基因组序列所示。本专利技术涉及重组牛分枝杆菌BCG，其过表达编码PhoP[SEQIDNO:1;SEQIDNO:2]和PhoR[SEQIDNO:3;SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其包含能够过表达的核酸，所述核酸编码PhoP和PhoR蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其包含能够过表达的核酸，所述核酸编码PhoP和PhoR蛋白。


2.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述PhoP和PhoR蛋白来自结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。


3.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸编码
(i)SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列；或
(ii)在SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失的PhoP蛋白；
(iii)SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列；或
(iv)在SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失的PhoR蛋白。


4.权利要求1的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸包含
(i)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列；
(ii)在严格杂交条件下与(i)的核苷酸序列杂交的序列；
(iii)与SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的序列；
(iv)SEQIDNO:4中所示的核苷酸序列；
(v)在严格杂交条件下与(iv)的核苷酸序列杂交的序列；
(vi)与SEQIDNO:4中所示的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的序列。


5.权利要求1-4中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述核酸分子已经历过修饰。


6.权利要求1-7中任何一项的活的重组牛分枝杆菌-BCG菌株，其中所述牛分枝杆菌-BCG菌株选自现有的BCG菌株，包括但不限于：牛分枝杆菌-BCG-Russia(ATCC编号:35740)、牛分枝杆菌-BCG-Moreau(ATCC编号:35736)、牛分枝杆菌-BCG-Japan(ATCC编号:35737)、牛分枝杆菌-BCG-Sweden(ATCC编号:35732)、牛分枝杆菌-BCG-Birkhaug(ATCC编号:35731)、牛分枝杆菌-BCG-Prague(ATCC编号:35742)、牛分枝杆菌-BCG-Glaxo(ATCC编号:35741)、牛分枝杆菌-BCG-Denmark(ATCC编号:35733)、牛分枝杆菌-BCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，
申请(专利权)人：成都永安制药有限公司，刘军，
类型：发明
国别省市：四川;51