茶氨酸的制造方法技术

根据本发明专利技术，通过使用以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性、以及γ‑谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的情况下高效地制造茶氨酸。

Manufacturing method of Theanine

According to the invention, theanine can be efficiently produced without adding ethylamine from the outside and without accumulating and residual ethylamine as a by-product by using microorganisms with acetaldehyde and alanine as substrates to generate ethylamine, and with \u03b3 - glutamine synthetase activity or glutamine enzyme activity enhanced.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】茶氨酸的制造方法
本专利技术涉及生成茶氨酸的微生物和使用该微生物的不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的、茶氨酸的高效制造方法。
技术介绍
茶氨酸是茶叶中所含的氨基酸的一种，已知作为鲜味的主要成分，是作为食品的香味成分的重要物质(专利文献1)。另外，近年来，已经明确其具有放松作用、咖啡因兴奋抑制作用和降血压作用等各种生理作用，作为食品添加剂的需求扩大。作为茶氨酸的制造方法，公开了使由假单胞菌属细菌得到的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺的方法(专利文献2)、使谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酶产生菌作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物的方法(专利文献3)、在ATP存在下使甲基营养菌所具有的γ-谷氨酰甲胺合成酶作用于谷氨酸和乙胺的方法(专利文献1)等，但这些方法中，在其制造步骤中需要添加乙胺作为反应底物。但是，由于乙胺的沸点非常低，因此在制造中无法避免乙胺的挥发，挥发的乙胺可能对周围环境和作业人员的身体产生不良影响。另外，例如在为了提高反应效率而要使乙胺在沸点以上的温度下反应时需要特殊的设备，上述方法在安全方面、成本方面存在问题(专利文献1)。因此，要求不从外部添加乙胺作为底物且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的茶氨酸的制造方法。后述的由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质(分别对应于图1和图2中的PP_5182、PP_0596、JM49_01725和RFLU_RS03325)为假单胞菌属细菌所具有的蛋白质，均作为氨基转移酶登记在数据库中(NCBI参考序列登记号：NP_747283、NP_742759、WP_012722053、GenBank登记号：AIS10430)。但是，未进行这些蛋白质实际作为氨基转移酶发挥功能的实验性验证，另外，也没有关于其底物和所催化的化学反应的见解。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2009-225705号公报专利文献2：日本特开平05-68578号公报专利文献3：日本特开平11-225789号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题如上所述，使用乙胺的现有的茶氨酸的制造方法在安全方面、成本方面存在问题。因此，本专利技术的课题在于提供不从外部添加乙胺的、茶氨酸的高效制造方法。用于解决问题的方法本专利技术涉及下述(1)～(10)项。(1)一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP，并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强。[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质(2)一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺，并且上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强。(3)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和γ-谷氨酰甲胺合成酶在含有乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。(4)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和谷氨酰胺酶在含有乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。(5)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，将上述(1)或(2)所述的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。(6)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。(7)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(2)所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。(8)如上述(1)或(2)所述的微生物，其中，微生物为属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物。(9)如上述(5)～(7)中任一项所述的茶氨酸的制造方法，其中，微生物为属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物。(10)如上述(1)或(2)所述的微生物，其中，碳源为糖。专利技术效果根据本专利技术，可提供生成茶氨酸的微生物和使用该微生物的不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的、茶氨酸的高效制造方法。附图说明图1表示基于使用γ-谷氨酰甲胺合成酶的发酵法的茶氨酸的制造方法中的、微生物内的假想代谢途径的示意图。AdhE：醇脱氢酶、YqhD：醛还原酶、EutE：醛脱氢酶、Ald：L-丙氨酸脱氢酶、Psyr_2273：γ-谷氨酰甲胺合成酶、PP_5182、PP_0596、JM49_01725和PFLU_RS03325：具有乙胺生成活性的蛋白质、TCA循环：柠檬酸循环图2表示基于使用谷氨酰胺酶的发酵法的茶氨酸的制造方法中的、微生物内的假想代谢途径的示意图。AdhE：醇脱氢酶、YqhD：醛还原酶、EutE：醛脱氢酶、Ald：L-丙氨酸脱氢酶、PP_5182、PP_0596、JM49_01725和PFLU_RS03325：具有乙胺生成活性的蛋白质、TCA循环：柠檬酸循环具体实施方式1.本专利技术的微生物和该微生物的制造方法1-1.乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物和该微生物的制造方法乙胺生成活性增强的微生物本专利技术的微生物是由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物。[1]具有序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列的蛋白质[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质突变蛋白质是指人为地使原蛋白质中的氨基酸残基缺失或置换、或者人为地在该蛋白质中插入或添加氨基酸残基而得到的蛋白质。同源蛋白质是指自然界中存在的生物所具有的、进化上的起源来源于同一蛋白质的一组蛋白质。同源蛋白质彼此的结构和功能类似。突变蛋白质中，缺失、置换、插入或添加有氨基酸可以是在同一序列中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP，并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强，/n[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；/n[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质；/n[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170413 JP 2017-0798931.一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP，并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强，
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质；
[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质。


2.一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺，并且权利要求1的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强。


3.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使权利要求1的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和γ-谷氨酰甲胺合成酶在含有乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。


4.一种茶氨酸的制造方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：田畑和彦，大野翔登，
申请(专利权)人：协和发酵生化株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP