一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一株通过改造大肠杆菌的代谢途径构建的高产L‑缬氨酸的基因工程菌，从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS并使其强表达；并在基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′‑焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；还敲除了硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。本发明专利技术解决了L‑缬氨酸合成代谢流偏弱、关键前体物丙酮酸供应不足导致L‑缬氨酸产率较低的问题。

A high yield L-valine gene engineering strain and its construction and Application

The invention provides a high-yield L-Valine-Producing gene engineering bacteria constructed by transforming the metabolic pathway of E.coli. Starting from E.coli W3110, the gene ALSS encoding acetolactate synthetase of Bacillus subtilis is integrated and strongly expressed in its genome, and the coding base of E.coli ppGpp 3 \u2032 - pyrophosphate hydrolase mutant [r290e, k292d] is integrated in its genome. Because of the strong expression of spot, we also knock out the gene of thie, which encodes the thiamine phosphate synthetase, and construct the gene engineering bacteria. The invention solves the problem of low yield of L \u2011 valine caused by weak metabolic current of L \u2011 valine synthesis and insufficient supply of pyruvate, a key precursor.

【技术实现步骤摘要】
一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于微生物领域和分子生物学领域，其中涉及一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
L-缬氨酸属于支链氨基酸，是一种人体必需氨基酸。L-缬氨酸在医学、食品及饲料领域有广泛的应用，具有很高的商业价值。L-缬氨酸在医学方面可以用作抗肿瘤药物，在食品方面可以用作食品添加剂。另外L-缬氨酸已经成为一种重要的饲料用氨基酸。目前L-缬氨酸的生产方法主要采用以葡萄糖为原料的微生物发酵法。L-缬氨酸合成支路途径从丙酮酸开始，经过以下几步反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合酶催化下形成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下形成α、β-二羟基异戊酸，该产物经二羟酸脱水酶催化后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶作用下形成L-缬氨酸。系统代谢工程作为一种菌株改良和工艺优化方法，已成功应用于包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸代谢育种。在L-缬氨酸产生菌的育种中，谷氨酸棒杆菌是最常见的出发菌株之一。2013年，HasegawaS等通过重构谷氨酸棒杆菌L-缬氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliW3110。


3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子Ptrc启动；所述ppGpp3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子Ptrc启动。


4.权利要求1-3任一项所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途。


5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：
将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.0；补加60％m/v葡萄糖溶液维持发酵进行；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖18g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，柠檬酸钠1g/L，MgSO4·7H2O0.7g/L，FeSO4·7H2O100mg/L，MnSO4·H...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，郝亚男，刘晓倩，蒋帅，门佳轩，刘益宁，文晨辉，李旋，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12