芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的工程菌株及应用制造技术

本发明专利技术涉及芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的工程菌株及应用，所述的枯草芽孢杆菌工程菌，将制备的融合基因片段cotX‑god‑SpyTag转化枯草芽孢杆菌WB800n，得到重组枯草芽孢杆菌WB800n‑cotX‑god‑SpyTag，再将融合基因片段P43‑cat‑SpyCatcher电转化重组枯草芽孢杆菌WB800n‑cotX‑god‑SpyTag感受态细胞，即得；实验发现通过相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher连接的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶互不影响，且表达的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的酶学性质有了明显改变，温度、pH适应范围广且耐温耐酸性能提高。

Engineering strains and application of CO display of glucose oxidase and catalase on spore surface

The invention relates to an engineering strain and application for CO displaying glucose oxidase and catalase on the spore surface. The engineering strain of Bacillus subtilis transforms the prepared fusion gene fragment Cotx \u2011 God \u2011 spytag into Bacillus subtilis wb800n, and obtains a recombinant Bacillus subtilis wb800n \u2011 Cotx \u2011 God \u2011 spytag, and then converts the fusion gene fragment p43 \u2011 cat \u2011 spycatcher into a recombinant Bacillus subtilis Bacillus wb800n \u2011 Cotx \u2011 God \u2011 spytag sensitive cells were obtained. It was found that the interaction peptides had no effect on the glucose oxidase and catalase linked by spytag / spycatcher, and the enzymatic properties of the expressed glucose oxidase and catalase were significantly changed, with a wide range of temperature and pH adaptation and improved temperature and acid resistance.

【技术实现步骤摘要】
芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的工程菌株及应用
本专利技术涉及芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的工程菌株及应用，属于生物技术

技术介绍
葡萄糖氧化酶(GOD)是一种氧化还原酶，在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。过氧化氢酶(CAT)，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于去除用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。芽孢表面展示是一项能在芽孢表面表达并展示具有生物活性的外源蛋白的技术，它将外源蛋白的基因与芽孢衣壳蛋白基因融合，从而将外源蛋白锚定在芽孢表面。(Isticatoetal.2001))第一次实现外源蛋白与枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白的融合表达，从此芽孢表面展示技术受到广泛的关注，枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术应用最普遍的原因是因为具有以下几种优势：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于GRAS分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；>(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。SpyTag和SpyCatche可通过自发反应形成共价键，产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性，在合成生物学和纳米
具有重要的应用价值。中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。该专利技术利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。将GOD和CAT通过芽孢衣壳蛋白和SpyTag和SpyCatche相互作用肽对共展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面，GOD和CAT的温度、pH适应范围广且耐温耐酸性能好，展示了诱人的工业应用前景和商业价值。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的工程菌株及应用。本专利技术利用SpyTag/SpyCatcher相互作用蛋白对以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白作为分子载体，在整合型质粒pDG1730和游离型质粒pHT01的基础上构建可以在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的载体，通过两次电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌，通过实验发现，通过该方式获得的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的酶学性质有了明显改变。本专利技术技术方案如下：芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向pDG1730载体中插入芽孢衣壳蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因和SpyTag基因的cotX-god-SpyTag基因片段，构建重组载体pDG1730-cotX-god-SpyTag；通过向pHT01质粒中插入P43启动子基因、过氧化氢酶基因和SpyCatcher基因的P43-cat-SpyCatcher基因片段，构建重组载体pHT01-P43-cat-SpyCatcher，然后两次转化枯草芽孢杆菌制得；所述cotX-god-SpyTag基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述cat-SpyCatcher基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。根据本专利技术优选的，所述载体为整合型载体pDG1730和游离型载体pHT01。根据本专利技术优选的，所述重组载体pDG1730-cotX-god-SpyTag的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述重组载体pHT01-P43-cat-SpyCatcher的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述枯草芽孢杆菌工程菌在制备葡萄糖酸盐中的应用。上述应用，步骤如下：(i)将上述枯草芽孢杆菌工程菌经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵96h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶；(ii)将步骤(i)制得的芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到葡萄糖溶液中，制得反应溶液；(iii)将步骤(ii)制得的反应溶液在30～70℃、pH4.0～8.0条件下，搅拌反应12～24h，制得混合溶液；(iv)将步骤(iii)制得的混合溶液中加入金属碱溶液至pH为10，制得金属碱混合液；(v)将步骤(iv)制得的金属碱混合液中固定化酶分离，洗涤回收，将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸盐。根据本专利技术优选的，所述步骤(i)中，活化培养条件为35～38℃、180～220rpm培养12～16h，活化培养基为液体LB培养基，组份如下：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/LNaCl，pH7.0。根据本专利技术优选的，所述步骤(i)中，扩大培养条件为35～38℃、180～220rpm培养84～108h，扩大培养培养基为TB培养基，组份如下：丙三醇15mL/L，胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，MgCl22.5g/L，17mMKH2PO4，72mMK2HPO4。根据本专利技术优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、8000rpm的条件下离心10min。根据本专利技术优选的，所述步骤(ii)中，葡萄糖溶液的浓度为20～200mM；优选为100mM。根据本专利技术优选的，所述步骤(iii)中，反应温度为40～50℃，反应pH为6.0～7.0，搅拌速率为150～400rpm，反应时间为4～8h；进一步优选的，反应温度为40℃，反应pH为6.0，搅拌速率为200～240rpm，反应时间为6h。根据本专利技术优选的，所述步骤(iv)中，金属碱溶液的浓度为50～500mM；进一步优选的，所述金属碱溶液的浓度为200～400mM；优选的，所述步骤(iv)中，分离采用离心。有益效果1、本专利技术首次同时利用芽孢衣壳蛋白作为分子载体和相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶共展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，得到一种可以在芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的基因工程菌，实验发现通过相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher连接的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶互不影响，且表达的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的酶学性质有了明显改变，温度、pH适应范围广且耐温耐酸性能提高；2、本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730与芽孢衣壳蛋白cotX和葡萄糖氧化酶基因god-SpyTag进行融合获得的融合基因片段cotX-god-SpyTag连接，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，得到重组枯草芽孢杆菌WB800n-cotX-god-SpyTag，再利用游离质粒pHT01与枯草强启动子P43基因、过氧化氢酶cat基因和SpyCatcher基因进行融合获得的融合基因片段P43-cat-SpyCatcher连接，然后电转化重组枯草芽孢杆菌WB800n-cotX-god-SpyTag感受态细胞，即得。/n

【技术特征摘要】
1.芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730与芽孢衣壳蛋白cotX和葡萄糖氧化酶基因god-SpyTag进行融合获得的融合基因片段cotX-god-SpyTag连接，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，得到重组枯草芽孢杆菌WB800n-cotX-god-SpyTag，再利用游离质粒pHT01与枯草强启动子P43基因、过氧化氢酶cat基因和SpyCatcher基因进行融合获得的融合基因片段P43-cat-SpyCatcher连接，然后电转化重组枯草芽孢杆菌WB800n-cotX-god-SpyTag感受态细胞，即得。


2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述融合基因片段cotX-god-SpyTag核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。


3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述融合基因片段P43-cat-SpyCatcher核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。


4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在制备葡萄糖酸盐中的应用。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(i)将上述枯草芽孢杆菌工程菌经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵96h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶；
(ii)将步骤(i)制得的芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到葡萄糖溶液中，制得反应溶液；
(iii)将步骤(ii)制得的反应溶液在30～70℃、pH4.0～8.0条件下，搅拌反应12～24h，制得混合溶液；
(iv)将步骤(iii)制得的混合溶液中加入金属碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，林平，刘洪玲，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37